c-Met抑制劑PHA665752對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)細(xì)胞的分裂、再生和運(yùn)動(dòng),它及其受體 c-Met異常高表達(dá)在卵巢癌進(jìn)展中起重要作用。凋亡抑制蛋白XIAP在卵巢癌的發(fā)生中也有著一定的關(guān)系,但關(guān)于三者在卵巢癌中的調(diào)控的研究目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組織化學(xué)檢測(cè) HGF及 c-Met在卵巢癌中的表達(dá)情況,再運(yùn)用 c-Met的特異性抑制劑PHA665752作用于卵巢癌SKOV-3后,觀察細(xì)胞增殖情況、凋亡改變及對(duì)XIAP的影響。為卵巢癌臨床治療提供理論依據(jù)。

2、r>　　方法:(1)免疫組織化學(xué)染色(EnVision法)及Image-ProPlus圖像分析軟件,觀察HGF及其受體在卵巢漿液性囊腺癌組織、卵巢漿液性囊腺瘤、卵巢交界性腫瘤和正常卵巢組織中的蛋白表達(dá)。
　　(2)以人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞系SKOV-3為研究對(duì)象,首先在37℃,5％CO2,20%O2和95%濕度條件下培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞,提取生長(zhǎng)指數(shù)期細(xì)胞,且生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。以不同濃度(0ng/ml、20 ng/ml、

3、40 ng/ml、80 ng/ml)的HGF和(0.5umol/l、1umol/l、2 umol/l)的PHA665752作用細(xì)胞后,于不同時(shí)間(24h、48h、72h)收集細(xì)胞,使用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)各組卵巢癌細(xì)胞的增殖及凋亡情況。
　　(3)PT-PCR、Western Blot檢測(cè)PHA6657522umol/l、HGF40 ng/ml作用細(xì)胞48小時(shí)后XIAP、HGF、c-Met的

4、改變情況。
　　(4)所得數(shù)據(jù)以錯(cuò)誤!未找到引用源。表示,多組間均數(shù)比較采用方差分析, p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)使用SPSS17.0軟件處理。
　　結(jié)果:(1)卵巢良性腫瘤HGF、c-Met的表達(dá)水平相對(duì)于正常對(duì)照組來說,增高不明顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),陽性率是20%、20%;卵巢惡性腫瘤HGF、c-Met的表達(dá)水平相對(duì)于良性腫瘤來說,增高明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),陽性率是60%、70%。<

5、br>　　(2)不同濃度(0ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、80 ng/ml)的HGF和(0 umol/l、0.5umol/l、1umol/l、2 umol/l)的PHA665752對(duì)卵巢癌存活率的影響:24h分別為(44.58%、53.77%、59.94%、63.97%)和(60.05%、57.31%、52.05%、44.58%);48h分別為(38.48%、84.33%、84.48%、81.85%)和(57.05%、

6、46.72%、39.28%、37.66%);72h分別為(29.26%、30.18%、31.23%、32.28%)和(49.26%、39.28%、32.41%、34.43%)。20 ng/ml HGF隨作用時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞增殖無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);而40 ng/ml、80 ng/mlHGF隨作用時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞存活率增高,各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05);當(dāng)作用24小時(shí)后隨著濃度增加,存活率無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)意義(p>0.05);當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)48h、72h,存活率隨濃度的提高而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。不同濃度的PHA665752作用24h后細(xì)胞增殖活性無明顯改變,統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無差異(p>0.05);而在48h、72h時(shí)隨著濃度的增加(1umol/l、2 umol/l),細(xì)胞存活率減少,各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05);0.5umol/lPHA665752隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞增殖活性也無明顯改變,統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無差異(p>

8、0.05),而1umol/l、2 umol/lPHA665752隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞存活率下降,各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
　　(3)不同濃度(0ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、80 ng/ml)的HGF和(0.5umol/l、1umol/l、2 umol/l)的PHA665752對(duì)卵巢癌凋亡率的影響:24h分別為(13.63%、13.27%、13.51%、13.20%)和(9.71%、10.33%

9、、14.13%、15.61%);48h分別為(14.37%、13.75%、9.87%、10.90%)和(10.66%、15.49%、30.61%、19.26%);72h分別為(14.18%、12.26%、11.45%、13.76%)和(14.09%、17.45%、27.19%、20.28%)。HGF實(shí)驗(yàn)組24h各濃度組間凋亡率無明顯差異,統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無差異(p>0.05),而在48h、72h隨著HGF濃度增加(40 ng/ml、80 ng

10、/ml),細(xì)胞凋亡降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)比較有差異(p<0.05)。PHA665752相同濃度時(shí),隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡率增加,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);0.5umol/lPHA665752作用24h后細(xì)胞凋亡率無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05),而在48h、72h是隨著濃度增加1umol/l、2 umol/l,凋亡率增加,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　(4)空白對(duì)照組HGF mRNA相對(duì)表達(dá)含量為0.

11、88±0.11、c-Met mRNA相對(duì)表達(dá)含量為0.85±0.14、XIAP mRNA相對(duì)表達(dá)含量為0.92±0.08,實(shí)驗(yàn)組 HGF40 ng/ml對(duì)卵巢癌SKOV3作用48h后,HGF mRNA相對(duì)表達(dá)含量為1.32±0.25、c-Met mRNA相對(duì)表達(dá)含量為1.69±0.16、XIAP mRNA相對(duì)表達(dá)含量為1.92±0.07;PHA6657521umol/l對(duì)卵巢癌SKOV3作用48h后,HGF mRNA相對(duì)表達(dá)含量為0.7

12、1±0.16、c-Met mRNA相對(duì)表達(dá)含量為0.49±0.05、XIAP mRNA相對(duì)表達(dá)含量為0.42±0.02。PHA665752處理組中各蛋白比空白組相對(duì)表達(dá)量低,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),HGF處理組中各蛋白比空白組中相對(duì)表達(dá)量高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　(5)空白對(duì)照組 XIAP蛋白表達(dá)量0.70±0.05,HGF處理組 XIAP蛋白表達(dá)量0.99±0.03,PHA665752處理組XIA

13、P蛋白表達(dá)0.34±0.03。HGF處理組XIAP蛋白表達(dá)量比空白組高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)、PHA665752處理組XIAP蛋白表達(dá)量比空白組低,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)?？瞻讓?duì)照組c-Met蛋白表達(dá)量0.69±0.03, HGF處理組c-Met蛋白表達(dá)量1.00±0.03,PHA665752處理組c-Met蛋白表達(dá)0.35±0.05。HGF處理組c-Met蛋白表達(dá)量比空白組高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05

14、)、PHA665752處理組c-Met蛋白表達(dá)量比空白組低,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　結(jié)論:(1)HGF、c-Met、XIAP在惡性卵巢癌中高表達(dá)。
　　(2)PHA665752可抑制c-Met,可使HGF/c-Met信號(hào)通路下調(diào),從而使HGFmRNA、c-MetmRNA、XIAPmRNA表達(dá)減少,蛋白表達(dá)量也減少,最終導(dǎo)致卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖減少,凋亡增加。
　　(3) HGF能使 HGFmRNA