c-Met及抑制劑在卵巢上皮性癌凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、來源于卵巢組織的惡性腫瘤是全球七大癌癥之一，新發(fā)病例中約有80％以上病例為III期-IV期，較早出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近二十年，卵巢癌發(fā)病率雖有所下降，死亡率卻是仍居高不下。卵巢癌發(fā)病隱匿、早期診斷較難，早期即多處擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及耐藥，致使卵巢癌患者死亡率為女性三大生殖器腫瘤之首。隨著卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)廣泛應(yīng)用、紫杉醇等一線化療藥物的應(yīng)用及分子生物學(xué)手段日新月異，I期患者生存率有了顯著提高，五年生存率能達(dá)到90%左右。III/IV期

2、患者通常經(jīng)過約兩年時(shí)間治療，多數(shù)病例出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥，因此五年存活率僅有25-30%。卵巢癌的發(fā)生、早期即遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、耐藥等是異常復(fù)雜的過程，多數(shù)病例就診時(shí)無特異性癥狀，高雌激素刺激、精神心理、遺傳等相關(guān)因素導(dǎo)致疾病發(fā)展。多步驟、多因素、多種關(guān)鍵分子或信號(hào)通路所致，通過影響卵巢癌細(xì)胞周期調(diào)控、增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。
　　原癌基因c-Met（cellular-mesenchymal to epithelial tran

3、sition factor）位于細(xì)胞膜，高親和力配體為肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）。c-Met在腫瘤組織中表現(xiàn)為過表達(dá)或異?；罨?，在甲狀腺癌、鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌組織學(xué)及細(xì)胞系中均已證實(shí)。c-Met位于人7號(hào)染色體（7q），具有酪氨酸激酶活性，參與多種細(xì)胞功能活動(dòng)。c-Met基因突變或c-Met蛋白過度表達(dá)激活下游多條信號(hào)通路PI3K/Akt、MAPK、STAT、Notch

4、，影響細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)、凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中c-Met蛋白過表達(dá)，腫瘤細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移、侵襲以及抗凋亡能力。研究證實(shí)減少c-Met蛋白過表達(dá)或者阻止c-Met自磷酸化及下游通路可有效調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡能力。
　　針對c-Met蛋白這一腫瘤重要靶標(biāo)，現(xiàn)已研發(fā)出特異性小分子抑制劑作為抗癌藥物。c-Met小分子抑制劑分為三型，Ib型抑制劑具有高選擇性，精確的結(jié)合c-Met非磷酸化構(gòu)象結(jié)合位

5、點(diǎn)，作為這類抑制劑的代表藥物Capmatinib(INCB28060，苯扎米特)，目前應(yīng)用于晚期肝癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、直腸癌、黑色素瘤、惡性膠質(zhì)瘤進(jìn)行I/II期臨床研究階段。國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道c-Met抑制劑INCB28060對卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，也無聯(lián)合紫杉醇對卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的研究，INCB28060是否能有效抑制c-Met及其下游PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，同時(shí)INCB28060聯(lián)合紫杉醇對c-Met下游

6、信號(hào)通路PI3K/Akt/mTOR是否有作用，是否影響卵巢癌生物學(xué)行為。
　　本研究以卵巢癌組織、正常卵巢組織、體外培養(yǎng)的卵巢癌SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞系、卵巢癌裸鼠荷瘤模型為研究對象，通過免疫組化、實(shí)時(shí)定量RT-PCR、Western-blot等方法檢測c-Met在卵巢癌組織、正常卵巢組織的表達(dá)情況；通過INCB28060抑制c-Met蛋白的表達(dá)，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)、Western-blot、MTT、TU

7、NEL等技術(shù)，研究c-Met蛋白在SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞中的表達(dá)、對下游PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路的影響、對卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響；構(gòu)建裸鼠荷瘤模型，了解INCB28060抑制c-Met蛋白表達(dá)后荷瘤裸鼠模型腫瘤體積變化，c-Met及下游通路PI3K/AKt/mTOR變化；以闡明c-Met在卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡過程中的重要影響，可能為卵巢癌基因治療探尋潛在靶向藥物提供理論依據(jù)。
　　第一部分：c-Met在卵巢癌

8、中的臨床病理表達(dá)
　　目的：
　　探討c-Met在卵巢癌、正常卵巢組織中的表達(dá)情況及其與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法：
　　選取2012.1-2012.12在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為上皮性卵巢癌標(biāo)本104例作為研究對象，及同期行子宮加雙附件切除術(shù)，病理證實(shí)為正常卵巢組織26例為對照組。采用免疫組化、RT-PCR及Western-blot方法比較c-Met在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)情況。

9、選取研究組病例患者年齡25-74歲之間，中位年齡55歲。FIGO分期：I-II期32例，III-IV期72例。組織學(xué)分級：G1級19例，G2-G3級85例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例49例。選取同期26例行子宮加雙附件切除術(shù)且病理證實(shí)卵巢無病變者為對照組。所有標(biāo)本分兩組，一組10%福爾馬林固定，一組投入液氮后再冷凍至-80℃待用。
　　結(jié)果：
　　1.c-Met在上皮性卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞漿及部分胞膜表達(dá)，104例卵巢癌

10、組織陽性率表達(dá)為74.04%；c-Met在正常卵巢組織細(xì)胞中表達(dá)較少，陽性表達(dá)率為11.54%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　2.c-Met在卵巢癌組織學(xué)分級G1級陽性表達(dá)率為52.63%、G2/G3級中陽性表達(dá)率為85.88%，比較兩組數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；c-Met蛋白在卵巢癌I/II期組織中陽性表達(dá)率為53.12%，III/IV期組織中陽性表達(dá)率為88.87%，比較兩組數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05

11、)；c-Met在卵巢癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)率為92.72%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)率為67.35%，比較兩組數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示c-Met在卵巢癌組織相對表達(dá)量（3.0786±0.09）高于正常卵巢組織中的相對表達(dá)量（1.0009±0.001），比較兩組數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　4.Western-blot結(jié)果顯示c-Met蛋白在卵巢癌組織的相對表達(dá)量為（0.979±0.0

12、09），明顯高于正常卵巢組織中的（0.263±0.003），兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　c-Met在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織，提示c-Met可能參與卵巢癌的發(fā)生；c-Met蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)與臨床分期、組織學(xué)級別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示c-Met參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
　　第二部分：INCB28060對卵巢癌細(xì)胞體外凋亡作用研究
　　目的：
　　探討

13、INCB28060作用卵巢癌細(xì)胞系c-Met、PI3K/Akt、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：
　　利用RT-PCR、Wertern-blot、MTT、TUNEL、流式細(xì)胞術(shù)檢測卵巢癌SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞c-Met的表達(dá)情況；向細(xì)胞系中加入不同濃度INCB28060，采用MTT法檢測抑制劑對卵巢癌細(xì)胞存活率的影響，流式細(xì)胞術(shù)、JC-1探針檢測細(xì)胞膜線粒體去極化和細(xì)胞周期變化；向細(xì)胞株中加入相同濃度INCB2

14、8060但作用時(shí)間不同，采用MTT法檢測其對細(xì)胞存活率的影響；向細(xì)胞株加入不同濃度紫杉醇，采用MTT法檢測INCB28060+紫杉醇對細(xì)胞存活率的影響；向細(xì)胞株加入同一濃度紫杉醇但作用時(shí)間不同，采用MTT檢測其對細(xì)胞存活率的影響；向細(xì)胞株加入INCB28060，采用Wertern-blot法檢測對c-Met及下游通路PI3K/Akt的影響，檢測p-c-Met、p-PI3K、p-AKt1、mTOR、Mdm2和p53的表達(dá)；應(yīng)用INCB28

15、060聯(lián)合紫杉醇作用細(xì)胞，Wertern-blot檢測細(xì)胞DNA損傷修復(fù)標(biāo)志物γH2AX的表達(dá)；用INCB28060聯(lián)合紫杉醇處理細(xì)胞，應(yīng)用TUNEL檢測細(xì)胞凋亡情況；
　　結(jié)果：
　　1.INCB28060處理卵巢癌SKOV3、OVCAR3細(xì)胞，與對照組相比用不同濃度（0umol/L、2umol/L、4umol/L、6umol/L和8umol/L）的INCB28060作用處理細(xì)胞，SKOV3、OVCAR3細(xì)胞存活率隨INC

16、B28060濃度的增加而下降，提示INCB28060對細(xì)胞存活率的影響為劑量依賴性，以6umol/L濃度最佳， SKOV3細(xì)胞存活率（50.12±2.369%）與對照組細(xì)胞存活率（97.23±3.71%）相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；OVCAR-3細(xì)胞存活率（65.72±1.996%）與對照組細(xì)胞存活率（97.62±2.98%）相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2.INCB28060處理 SKOV3、OVCAR3細(xì)胞

17、， MTT檢測6umol/L INCB28060不同培養(yǎng)時(shí)間（0h、12h、24h、36h和48h）細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示， SKOV3、OVCAR3細(xì)胞存活率隨作用時(shí)間延長而下降，提示INCB28060對卵巢癌細(xì)胞的影響是呈時(shí)間依賴性的，以24h為最佳， SKOV3細(xì)胞存活率（51.92±1.996%）與對照組細(xì)胞存活率（98.19±3.69%）相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；OVCAR3細(xì)胞存活率（63.27±3.061%）與對照

18、組細(xì)胞存活率（96.91±3.84%）相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　3.單獨(dú)應(yīng)用6 umol/L INCB28060以及聯(lián)合紫杉醇與 SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞共同培養(yǎng)，MTT檢測不同濃度紫杉醇（0 nM、10 nM、20 nM、30 nM、40 nM）對細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示，紫杉醇濃度以20 nM最佳，SKOV3、OVCAR3細(xì)胞存活率依劑量增加而降低，呈劑量依賴性；SKOV3細(xì)胞存活率為（49.91±2.

19、167%）與對照組細(xì)胞存活率（98.23±3.994%）相比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；OVCAR-3細(xì)胞存活率為（59.72±1.991%）與對照組細(xì)胞存活率（97.83±3.269%）相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；單獨(dú)應(yīng)用6 umol/L INCB28060以及聯(lián)合20 nM紫杉醇處理SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞，MTT檢測不同作用時(shí)間（0 h、12 h、24 h、36 h、48 h）對細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果顯示，作用

20、時(shí)間以24 h最佳， SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞存活率依時(shí)間延長而降低，呈時(shí)間依賴性；SKOV3細(xì)胞存活率為49.91±2.167%與對照組細(xì)胞存活率96.23±3.99%相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；OVCAR-3細(xì)胞存活率為53.17±2.02%與對照組細(xì)胞存活率96.19±4.10%相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；
　　4.不同濃度INCB28060與SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測c-Met、p-c

21、-Met、p-PI3k、p-Akt的表達(dá)。結(jié)果顯示，應(yīng)用抑制劑INCB28060的卵巢癌SKOV3、OVCAR3細(xì)胞p-c-Met、p-PI3k、p-AKt蛋白表達(dá)量隨著INCB28060濃度增加表達(dá)下降，呈劑量依賴性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　5.流式細(xì)胞儀檢測不同濃度INCB28060與SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞線粒體去極化膜電位比例以及去極化與極化比值。結(jié)果顯示：隨著濃度增加兩株細(xì)胞線粒體去極化比例

22、增加，以6umol/L最佳，SKOV3細(xì)胞線粒體膜電位去極化比例為（65.77±3.26%），與對照組相比較（8.41±0.26%），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；OVCAR-3細(xì)胞線粒體膜電位去極化比例為（56.81±2.51%），與對照組相比較（7.34±0.30%），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞去極化與極化比例，結(jié)果顯示：隨著INCB28060濃度增加，比例隨之增加，SKOV3細(xì)胞線粒體去極化與極化比值為（0.

23、83±0.041%），與對照組相比較（0.17±0.006%），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；OVCAR-3細(xì)胞線粒體去極化與極化比值為（0.77±0.039%），與對照組相比較（0.18±0.006%），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；
　　6.INCB28060對SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞DNA損傷能力的影響應(yīng)用Western blot檢測γH2AX，觀察6 umol／L INCB28060及聯(lián)合20 nM紫杉醇對 SKOV

24、3、OVCAR3細(xì)胞γH2AX的影響，結(jié)果顯示， INCB28060及聯(lián)合紫杉醇對SKOV3、OVCAR3細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞DNA損傷程度增強(qiáng)，與對照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　7.流式細(xì)胞學(xué)檢測INCB28060及聯(lián)合紫杉醇對SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞周期影響
　　INCB28060聯(lián)合紫杉醇作用于SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞。共同作用隨時(shí)間遞增，INCB28060聯(lián)合紫杉醇作用SKOV3細(xì)胞G2/M期細(xì)

25、胞比例（23.44±1.026%），明顯低于單用INCB28060組細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例（29.99±1.391%），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；INCB28060聯(lián)合紫杉醇作用OVCAR-3細(xì)胞處于G2/M期細(xì)胞比例（21.17±1.167%），明顯低于對照組（31.73±1.4%），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；INCB28060聯(lián)合紫杉醇作用SKOV3細(xì)胞 Sub-G1期比例（47.26±1.98%），與單用 INCB2806

26、0（21.78±1.01%）或紫杉醇組（18.71±0.92%）比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；INCB28060聯(lián)合紫杉醇作用 OVCAR-3細(xì)胞 Sub-G1期比例（43.94±2.0016%），與單用 INCB28060（18.73±0.95%）或紫杉醇組（21.16±1.06%）比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；
　　結(jié)論：
　　1.應(yīng)用INCB28060抑制卵巢癌SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞存活率，存在劑量

27、依賴性及時(shí)間依賴性。
　　2.應(yīng)用INCB28060抑制卵巢癌SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞c-Met蛋白表達(dá)。
　　3應(yīng)用INCB28060作用卵巢癌SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞抑制c-Met下游通路PI3K/AKt。
　　4應(yīng)用INCB28060作用卵巢癌SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　5應(yīng)用INCB28060作用卵巢癌SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞，可能增加腫瘤細(xì)

28、胞對化療藥物紫杉醇敏感性。
　　第三部分：INCB28060聯(lián)合紫杉醇作用于卵巢癌裸鼠荷瘤模型的實(shí)驗(yàn)觀察
　　目的：構(gòu)建卵巢癌裸鼠荷瘤模型，并觀察INCB28060聯(lián)合紫杉醇對卵巢癌裸鼠荷瘤模型的作用。
　　方法：
　　1培養(yǎng)卵巢癌SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞株；
　　2構(gòu)建裸鼠荷瘤模型；
　　3 INCB28060及紫杉醇干預(yù)裸鼠荷瘤生長；
　　4 Western blot法檢測腫瘤細(xì)胞c-

29、Met及下游通路PI3K/AKt表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1成功構(gòu)建卵巢癌裸鼠荷瘤模型。
　　2應(yīng)用INCB28060及紫杉醇干預(yù)卵巢癌裸鼠荷瘤模型，結(jié)果提示， INCB28060+紫杉醇聯(lián)合用藥組的腫瘤體積最?。?40.19±26.11mm3），與對照組（930.22±29.10mm3）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。INCB28060+紫杉醇聯(lián)合用藥組的腫瘤質(zhì)量最輕（900.094±56.099mg），與對照組

30、（1630.194±68.031mg）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。INCB28060+紫杉醇聯(lián)合用藥組的裸鼠荷瘤模型體重（2150.987±0.096mg），與對照組（2070.238±0.079mg）比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3 Western blot法對腫瘤組織的c-Met、p-c-Met、PI3K、p-PI3K、AKt1、p-AKt1、mTOR、p-mTOR、mdm2、p53蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)

31、論：
　　1.成功構(gòu)建卵巢癌裸鼠荷瘤模型。
　　2.應(yīng)用INCB28060及紫杉醇干預(yù)裸鼠荷瘤模型，能有效縮小成瘤體積、減輕腫瘤質(zhì)量。
　　3.INCB28060抑制c-Met及下游通路PI3K/AKt，抑制細(xì)胞增生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論
　　1.上皮性卵巢癌組織c-Met基因表達(dá)上調(diào)，c-Met蛋白呈高表達(dá)。
　　2.INCB28060可通過抑制c-Met的表達(dá)調(diào)控下游通路PI3K/AKT，

32、 p-c-Met、p-PI3k、p-AKT的表達(dá)量均下降，可通過調(diào)控c-Met及下游通路mTOR、Mdm2、p53、γH2AX自磷酸化的表達(dá)，干擾卵巢癌細(xì)胞株的增殖、存活、促進(jìn)凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期，可能提高對紫杉醇化療藥物的敏感性。
　　3.應(yīng)用INCB28060能夠降低荷瘤裸鼠腫瘤體積，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)可能增加對紫杉醇化療藥物的敏感性。
　　4.INCB28060可能是卵巢癌未來潛在的靶點(diǎn)藥物，有望為卵巢癌的輔助治療帶來新