醛固酮誘導(dǎo)DOT1-AF9調(diào)控ET1表達(dá)在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、研究背景：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)病率逐年升高，已成為終末期腎臟疾病的重要病因。DN主要表現(xiàn)為腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。DN發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜。糖代謝紊亂和血流動力學(xué)改變是腎臟疾病的基礎(chǔ)，眾多的生長因子和細(xì)胞因子被激活直接參與DN的形成。近年來，作為RAAS系統(tǒng)的重要成員，醛固酮在腎臟疾病中的作用越來越受到學(xué)者的重視。醛固酮參與5/6殘余腎模型、自發(fā)性高血壓、梗阻性腎病、糖尿病腎病等多種腎臟疾病的發(fā)生

2、發(fā)展。醛固酮與鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合后能調(diào)控多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致水鈉潴留，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，上調(diào)多種促纖維化因子表達(dá)，促進(jìn)糖尿病腎病的進(jìn)展。
　　 近來研究證實，醛固酮通過影響組蛋白甲基化酶Dot1調(diào)控ENaCα基因的表達(dá)。Dot1是一種無SET結(jié)構(gòu)域的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，它能通過催化H3K79甲基化來建立和維持染色質(zhì)的沉默，參與多種疾病的發(fā)生。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)Dot1與轉(zhuǎn)錄因子AF9結(jié)合形成復(fù)合物結(jié)合在ENaC

3、啟動子區(qū)域，調(diào)控ENaCα的表達(dá)；醛固酮能下調(diào)Dot1與AF9表達(dá)，從而上調(diào)ENaC基因表達(dá)。醛固酮通過Dot1/AF9介導(dǎo)對ENaC基因表達(dá)的調(diào)控。這種機(jī)制可能存在于醛固酮調(diào)控的其他基因。
　　 有研究表明，內(nèi)皮素(ET-1)系醛固酮所轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的靶基因之一。ET-1是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)最強(qiáng)的血管收縮生物活性物質(zhì)，具有收縮腎血管，減少血流量，增加胰島素抵抗，趨化炎性細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成等生物學(xué)效應(yīng)，在DN發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

4、醛固酮是否通過Dot1/AF9上調(diào)ET-1基因表達(dá)，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，查閱近10年公開發(fā)表的文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的研究報道。
　　 目的：觀察高糖環(huán)境下醛固酮對ET-1表達(dá)的影響，探討Dot1/AF9在醛固酮調(diào)控ET-1表達(dá)中的作用，研究醛固酮在糖尿病腎病模型鼠中對Dot1、AF9、ET-1的影響及安體舒通干預(yù)作用。
　　 方法：
　　 1.分別采用低糖(含葡萄糖1000mg/L)、高糖(含葡萄糖4500m

5、g/L)、含不同濃度醛固酮(10nM，25nM，50nM，100nM)的高糖DMEM培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞(normal rat kidney cells，NRK-52E)，采用RT-PCR、Western免疫印跡、免疫熒光檢測等方法分別檢測各組Dot1、AF9和ET-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化情況；
　　 2.分別采用低糖、高糖、含醛固酮(50nM)和安體舒通(100nM)的高糖DMEM干預(yù)NRK-52E，采用RT-PCR、

6、Western免疫印跡、免疫熒光檢測等方法分別檢測各組Dot1、 AF9和ET-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化情況；
　　 3.建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Dot1/AF9質(zhì)粒的細(xì)胞株，采用低糖、高糖和含醛固酮(50nM)的DMEM干預(yù)未轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Dot1/AF9質(zhì)粒的NRK-52E，采用RT-PCR、Western免疫印跡、免疫熒光檢測等方法分別檢測各組Dot1、 AF9和ET-1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化情況；
　　 4.采用STZ

7、誘導(dǎo)建立DN大鼠模型，分為正常組(N組)、糖尿病腎病組(DN組)、安體舒通干預(yù)組(SP組，給予安體舒通40mg/(kg*d)干預(yù)DN大鼠)三組，檢測大鼠尿蛋白，血肌酐，血清和腎組織中醛固酮水平等，采用RT-PCR、免疫組化、Western免疫印跡等方法檢測Dot1、AF9和ET-1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.高糖環(huán)境下，腎小管上皮細(xì)胞Dot1和AF9 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)降低，而ET-1 mRNA

8、和蛋白質(zhì)呈高表達(dá)。醛固酮刺激后，腎小管上皮細(xì)胞Dot1和AF9 mRNA和蛋白質(zhì)仍呈低表達(dá)，而ET-1 mRNA和蛋白質(zhì)出現(xiàn)明顯高表達(dá)。
　　 2.安體舒通干預(yù)實驗后，高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞Dot1和AF9mRNA和蛋白質(zhì)均表達(dá)上調(diào)，而ET-1mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　 3.高糖環(huán)境下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Dot1/AF9質(zhì)粒的NRK-52E細(xì)胞用醛固酮刺激后，其Dot1/AF9表達(dá)呈高水平，ET-1蛋白質(zhì)明顯低于未轉(zhuǎn)染Dot1

9、/AF9質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的NRK-52E細(xì)胞中ET-1的蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　 4.DN大鼠血糖、血壓升高，尿蛋白排泄增加，血肌酐升高，腎臟病理呈糖尿病早期病理改變。與N組比較，雖然DN大鼠血清醛固酮水平無明顯改變，但腎組織局部醛固酮含量明顯升高。
　　 5.DN大鼠腎組織局部醛固酮含量明顯升高的同時，Dot1mRNA和AF9mRNA和蛋白表達(dá)的下調(diào)，而腎組織ET-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高。
　　 6.采用安

10、體舒通干預(yù)DN大鼠，與DN組比較，SP組大鼠血壓、血糖等無明顯變化，但尿蛋白減少，血肌酐降低，腎臟病理改變減輕，腎組織Dot1和AF9mRNA和蛋白表達(dá)的上調(diào)，而ET-1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.高糖環(huán)境下醛固酮刺激腎小管上皮細(xì)胞后，Dot1和AF9呈低表達(dá)，而ET-1出現(xiàn)高表達(dá)。安體舒通干預(yù)實驗和Dot1和AF9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，腎小管上皮細(xì)胞Dot1和AF9表達(dá)上調(diào)，而ET-1表達(dá)下調(diào)，證實醛固酮

11、通過影響Dot1和AF9表達(dá)進(jìn)而調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞ET-1基因轉(zhuǎn)錄。
　　 2.DN模型鼠出現(xiàn)腎間質(zhì)損傷的同時，腎臟組織局部醛固酮水平升高，腎組織中Dot1和AF9低表達(dá)，而ET-1出現(xiàn)高表達(dá)，提示腎臟局部組織中高醛固酮水平可能參與了DN發(fā)病過程，且可能與醛固酮影響Dot1和AF9表達(dá)調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞ET-1基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。
　　 3.安體舒通干預(yù)實驗后，糖尿病腎病腎間質(zhì)損傷減輕的同時，腎組織中Dot1和AF9表達(dá)上調(diào)，