臍血造血干-祖細(xì)胞在絲素膜上向內(nèi)皮細(xì)胞分化及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：體外分離、純化臍血CD34+造血干/祖細(xì)胞(CD34+細(xì)胞),誘導(dǎo)其在再生絲素膜上向內(nèi)皮細(xì)胞分化,并通過對其分化過程中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)活化的研究,初步揭示CD34+細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的部分機(jī)制。
　　 方法：采集新鮮臍血,磁珠分選法(MACS)分離出CD34+細(xì)胞,分別接種到再生絲素膜(SF)和明膠包被的培養(yǎng)皿上,用含有VEGF和纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的M19

2、9培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察CD34+細(xì)胞生長情況,流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)前后內(nèi)皮細(xì)胞CD34,CD31及vWF表型,電鏡觀察驗(yàn)證內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)的Weibel-Palade小體(W-P小體),并比較不同材料上CD34+細(xì)胞的貼壁率及向內(nèi)皮細(xì)胞分化比率。進(jìn)一步以絲素蛋白膜為載體培養(yǎng)WI-38人胚肺成纖維細(xì)胞,將本科室已構(gòu)建的腺病毒介導(dǎo)的與干細(xì)胞內(nèi)皮化密切相關(guān)的VEGF165基因(即Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang

3、1重組腺病毒)轉(zhuǎn)染W(wǎng)I-38細(xì)胞,用熒光顯微鏡、RT-PCR及ELISA法檢測VEGF165及Ang-1基因在WI-38細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；并將此基因轉(zhuǎn)染W(wǎng)I-38修飾的再生絲素膜倒置漂浮于接種于再生絲素膜上的CD34+細(xì)胞的培養(yǎng)基液面上共培養(yǎng),通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,流式細(xì)胞儀檢測內(nèi)皮細(xì)胞CD31表型等方法與直接加入細(xì)胞因子誘導(dǎo)的方式比較CD34+細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞分化率。另外,用Western印跡法檢測分離的CD34+細(xì)胞和誘導(dǎo)分化7d、1

4、4d細(xì)胞中JAK蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)和STAT-3蛋白的表達(dá)及其在VEGF作用下的磷酸化水平；以細(xì)胞因子VEGF(50 ng/ml)持續(xù)刺激分化14d細(xì)胞不同時(shí)間(5、10、30、60 min)后,Western印跡法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞內(nèi)STAT-3的磷酸化及轉(zhuǎn)核；采用能與VEGF受體2(VEGFR2)特異性結(jié)合的七肽ATWLPPR封閉VEGF與VEGFR2的結(jié)合,Western印跡法觀察VEGF刺激分化14d細(xì)胞后STA

5、T-3的磷酸化水平；采用JAK-STAT信號通路特異性抑制劑AG490作用于分化14d細(xì)胞,Western印跡法檢測VEGF刺激后細(xì)胞內(nèi)磷酸化STAT3的表達(dá),同時(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞儀檢測剛分離的CD34+細(xì)胞加入AG490共培養(yǎng)后的細(xì)胞生長和分化情況。
　　 結(jié)果：⑴本實(shí)驗(yàn)成功將CD34+細(xì)胞在絲素膜材料上誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)2w時(shí)細(xì)胞長滿瓶底并達(dá)到增殖高峰,呈“鋪路石”狀排列；流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)10d

6、的細(xì)胞顯示內(nèi)皮細(xì)胞表型CD31陽性率達(dá)70％以上,檢測培養(yǎng)14d的細(xì)胞顯示vWF陽性率可達(dá)80％以上；透射電鏡可觀察到胞漿中的W-P小體;平均貼壁率和分化比率分別可達(dá)80％及60％以上,且再生絲素膜對CD34+細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化沒有負(fù)面影響。⑵培養(yǎng)于再生絲素膜上的WI-38細(xì)胞經(jīng)Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang1重組腺病毒感染后,呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光,VEGF165及Ang-1基因在WI-38細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄,ELIS

7、A法證實(shí)Ad-VEGF165-PolyA-promoter-Ang1能在WI-38細(xì)胞中持續(xù)地高表達(dá)VEGF165,Ang-1和FGF2等細(xì)胞因子,將此基因轉(zhuǎn)染W(wǎng)I-38細(xì)胞修飾的再生絲素膜與CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)第7d時(shí),CD34+細(xì)胞的細(xì)胞增殖倍數(shù)、內(nèi)皮細(xì)胞分化比率以及內(nèi)皮細(xì)胞表型CD31陽性率均比加入細(xì)胞因子直接誘導(dǎo)組及其他空白對照組要高,說明基因轉(zhuǎn)染W(wǎng)I-38修飾的再生絲素膜可以更有效的誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞相內(nèi)皮方向分化。⑶分離的C

8、D34+細(xì)胞和誘導(dǎo)分化7d、14d的細(xì)胞在正常靜止?fàn)顟B(tài)下,均表達(dá)一定量的JAK2,而且在所有的時(shí)間點(diǎn)JAK2蛋白的表達(dá)量類似,隨著細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化酪氨酸磷酸化JAK2水平明顯增加；STAT3在CD34+細(xì)胞分化前即有明顯表達(dá),隨著向內(nèi)皮分化,其表達(dá)量增加,且隨著內(nèi)皮細(xì)胞的分化成熟,STAT3的酪氨酸磷酸化水平提高；VEGF刺激分化14d細(xì)胞后胞內(nèi)可出現(xiàn)迅速而短暫的STAT3磷酸化及轉(zhuǎn)核,且其刺激后不同時(shí)間的STAT3酪氨酸磷酸化水平有

9、顯著性差異,VEGF刺激對STAT3分子活化具有一定的時(shí)間依賴性；ATWLPPR特異性封閉VEGF與VEGFR2的結(jié)合后,STAT-3磷酸化被完全阻斷；AG490特異性封閉JAK-STAT信號通路后,經(jīng)VEGF刺激仍可檢測到有一定量的磷酸化的STAT3表達(dá),且VEGF+AG490培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞,仍然可以在一定程度上向內(nèi)皮細(xì)胞分化。表明VEGFR2特異性的介導(dǎo)的STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能參與了VEGF誘導(dǎo)的CD34+細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化

10、的調(diào)控機(jī)制,同時(shí)可能有其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了VEGF對CD34+細(xì)胞的促分化作用。
　　 結(jié)論：①成功將CD34+細(xì)胞在VEGF等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下分化為內(nèi)皮細(xì)胞；②再生絲素膜可作為CD34+細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的支架材料；③Ad-VEGF165-PolyA—promoter-Ang1重組腺病毒轉(zhuǎn)染W(wǎng)I-38細(xì)胞修飾的再生絲素膜能更有效的誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞向內(nèi)皮方向分化；④VEGFR2特異性的介導(dǎo)的STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能參與了VE