ADAM17在U87膠質(zhì)瘤干細(xì)胞遷移和侵襲中的運(yùn)用及機(jī)制.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，在所有顱內(nèi)腫瘤中約占35.26％-60.96％，平均44.69％。盡管外科手術(shù)水平，放療、化療技術(shù)不斷提高，但并沒(méi)能顯著改善腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOⅣ級(jí)膠質(zhì)瘤）患者平均生存期僅為14個(gè)月。腫瘤細(xì)胞高度侵襲性是膠質(zhì)瘤高死亡率的主要原因，同時(shí)也是膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中重要的生物學(xué)標(biāo)志，與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。圍繞著腫瘤侵襲機(jī)制的研究一直以來(lái)是膠質(zhì)瘤研究的重點(diǎn)。

2、
　　 腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是多基因、多步驟相互作用的過(guò)程，主要包括惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶遷移粘附到細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)、降解并穿過(guò)ECM和基膜、通過(guò)血管進(jìn)入宿主微環(huán)境等步驟。目前觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)胞外基質(zhì)降解酶系統(tǒng)如基質(zhì)金屬蛋白酶家族(Matrixmetalloproteinases，MMps)和去整合素-金屬蛋白酶家族(a disintegrin and metalloproteases，ADAM

3、s)等參與了腫瘤侵襲過(guò)程。ADAM17又稱為腫瘤壞死因子a前體轉(zhuǎn)換酶(Tumor necrosis factor-alphaConverting Enzyme，TACE)，是去整合素-金屬蛋白酶(a disintegrin andmetalloproteinase，ADAMs)家族重要成員之一。由于具有水解細(xì)胞膜上的腫瘤壞死因子，同時(shí)能酶解活化多種表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的配體，激活EGFR相關(guān)信號(hào)通道，與腫瘤的侵襲密切相關(guān)。ADA

4、M17在腫瘤侵襲機(jī)制中的作用研究日益成為研究的熱點(diǎn)。
　　 近來(lái)發(fā)現(xiàn)ADAM17在多種腫瘤組織中高表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，腎癌，前列腺和胰腺癌等。研究表明ADAM17同樣在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。Zheng等構(gòu)建針對(duì)ADAM17的ShRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染處理人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，揭示ADAM17 shRNA干擾后U87細(xì)胞增殖，粘附和侵襲能力降低，凋亡增加。絕大部分膠質(zhì)瘤屬于實(shí)體性腫瘤。實(shí)體

5、性腫瘤細(xì)胞的侵襲是一個(gè)涉及基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)降解;腫瘤細(xì)胞增殖、粘附、遷移;腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管生成;腫瘤細(xì)胞通過(guò)血管轉(zhuǎn)移的復(fù)雜過(guò)程。結(jié)合ADAM17自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，酶裂解的生物學(xué)功能及其活化胞內(nèi)多條信號(hào)通路的特性，推斷ADAM17在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用:其一，ADAM17能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、明膠和彈性纖維（構(gòu)成基底膜的主要成分），使細(xì)胞間質(zhì)的空隙增大，為腫瘤血管的形成提供有利的空間，參與膠

6、質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移;其二，ADAM17還可以增強(qiáng)促血管生成因子的作用，與多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá)或分泌密切相關(guān)，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及受體(VEGF/VEGFR)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)、成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、趨化因子（chemokines）、表皮生長(zhǎng)因子及受體(EGF/EGFR)、白細(xì)胞介素(IL)等，直接或間接參與腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤遷移和侵襲。其三，ADAM17可以剪切脫落和活化腫瘤壞死因子a(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(

7、TGF-α)，白介素6(IL-6)、雙調(diào)蛋白(AR)等多種表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的配體，激活EGFR相關(guān)通道。由酪氨酸蛋白激酶活化引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活P13K/AKT、MEK/ERK等多條信號(hào)通路，最終影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。ADAM17通過(guò)激活EGFR及其下游相關(guān)信號(hào)通路在介導(dǎo)腫瘤侵襲中發(fā)揮至關(guān)重要作用，因此研究ADAM17和所調(diào)控EGFR相關(guān)信號(hào)通路（（PI3K/AKT和MEK/ERK通路）在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況和對(duì)膠質(zhì)

8、瘤遷移和侵襲的調(diào)控機(jī)制，尤其是始動(dòng)環(huán)節(jié)的介導(dǎo)作用，對(duì)于進(jìn)一步了解ADAM17的功能、作用機(jī)制及膠質(zhì)瘤侵襲性機(jī)制有著重要的意義。
　　 腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)理論的提出深化了人們對(duì)于惡性膠質(zhì)瘤起源的認(rèn)識(shí)，也為研究腫瘤侵襲性的調(diào)控機(jī)制，尤其是始動(dòng)環(huán)節(jié)的介導(dǎo)作用等問(wèn)題提供了新思路。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在腫瘤內(nèi)部存在著一組具有干細(xì)胞特性的小的細(xì)胞集群一腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，C

9、SCs)或稱腫瘤始動(dòng)細(xì)胞(tumorinitiating cells)。膠質(zhì)瘤CSCs即膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells，GSCs)表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD133和神經(jīng)巢蛋白(nestin)，并具有自我更新、多向分化以及體內(nèi)成瘤的能力，可以分化成多種子代細(xì)胞成分，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且與腫瘤的化療耐藥性及放療抗性密切相關(guān)，因此在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了決定性作用，被認(rèn)為可能是膠質(zhì)瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、治療抵抗以及復(fù)發(fā)的

10、根源。然而，這群GSCs在膠質(zhì)瘤侵襲中所扮演的角色尚不清楚:它們是否始動(dòng)或參與了膠質(zhì)瘤侵襲過(guò)程？其分子機(jī)制如何？新近我們發(fā)現(xiàn)，GSCs高表達(dá)ADAM17，具體生物學(xué)功能意義不清?？紤]到ADAM17在EGFR相關(guān)信號(hào)通路激活起“起始開(kāi)關(guān)”，與腫瘤遷移和侵襲密切相關(guān)。我們推測(cè)，GSCs高表達(dá)的ADAM17能夠通過(guò)活化EGFR及下游相關(guān)信號(hào)通路(PI3K/AKT和MEK/ERK)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤遷移和侵襲。
　　 本研究中，我們首先觀測(cè)在

11、不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中ADAM17表達(dá)情況及臨床意義，明確ADAM17表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別成正相關(guān)，有望成為抗膠質(zhì)瘤治療新的靶點(diǎn);然后，我們檢測(cè)了GSCs標(biāo)志物CD133在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87的表達(dá)，并從中成功分離、培養(yǎng)和鑒定出GSCs;研究了ADAM17在GSCs中的表達(dá)及ADAM17基因敲除或化學(xué)增強(qiáng)劑活化后對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞遷移和侵襲的影響;最后，我們探討了EGFR相關(guān)信號(hào)通路（PI3K/AKT和MEK/ERK）在ADAM17調(diào)控GS

12、Cs介導(dǎo)的腫瘤遷移和侵襲中的作用機(jī)制，證實(shí)ADAM17可能通過(guò)調(diào)控EGFR及其下游PI3K/AKT信號(hào)通路影響GSCs遷移和侵襲。
　　 第一部分ADAM17在不同惡性程度膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義
　　 目的：探討ADAM17在不同惡性程度膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系。
　　 方法收集103例手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織及14例癲癇顳葉切除的相對(duì)正常腦組織，應(yīng)用熒光定量PCR、免疫組化染色等方法檢測(cè)組織

13、標(biāo)本中ADAM17基因、蛋白的表達(dá)情況，并與膠質(zhì)瘤的惡性程度進(jìn)行Spearman相關(guān)分析;利用預(yù)后生存分析探討膠質(zhì)瘤組織中ADAM17的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。
　　 結(jié)果膠質(zhì)瘤組織的ADAM17表達(dá)高于正常腦組織(P＜0.01)，與膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別呈正相關(guān)(r=0.76);預(yù)后生存分析顯示高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者ADAM17高表達(dá)預(yù)示著較短的生存時(shí)間;Cox回歸多因素分析顯示ADAM17是膠質(zhì)瘤患者獨(dú)立的預(yù)后危險(xiǎn)因素。
　　

14、 結(jié)論檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中ADAM17的表達(dá)水平有助于評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為和患者的預(yù)后，具有臨床研究?jī)r(jià)值。
　　 第二部分人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中分選、培養(yǎng)和鑒定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞
　　 目的：從人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中分選、培養(yǎng)和鑒定膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，為研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲性奠定基礎(chǔ)。
　　 方法選擇人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87，利用流式細(xì)胞儀分選出CD133+的細(xì)胞。通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基（DMEM/F12+20ng/mL b

15、FGF+20ng/mL EGF+100μl B27）培養(yǎng)獲得呈懸浮生長(zhǎng)的U87腫瘤干細(xì)胞球;利用免疫熒光、western-blot對(duì)U87腫瘤干細(xì)胞球形態(tài)、自我更新能力、免疫表型、多向分化能力進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果 CD133+U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中呈克隆球樣懸浮生長(zhǎng)，并且能夠傳代增殖。經(jīng)免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)，腫瘤球細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志CD133和Nestin。將腫瘤球在含血清培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化，表現(xiàn)多向

16、分化潛能，產(chǎn)生表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)、神經(jīng)元(β-tubulinⅢ)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(GAlC)的子代腫瘤細(xì)胞。
　　 結(jié)論人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中存在著一組具有干細(xì)胞特性的小的細(xì)胞集群(GSCs)，利用流式細(xì)胞儀分選和無(wú)血清培養(yǎng)劑能有效的分離和擴(kuò)增U87細(xì)胞系中的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。
　　 第三部分ADAM17通過(guò)調(diào)控EGFR信號(hào)通路影響膠質(zhì)瘤干細(xì)胞遷移和侵襲
　　 目的：研究ADAM17對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSC

17、s)遷移和侵襲的影響，并探索EGFR相關(guān)信號(hào)通路(PI3K/AKT和MEK/ERK)在ADAM17調(diào)控GSCs介導(dǎo)的腫瘤遷移和侵襲中的作用機(jī)制。
　　 方法分別采用免疫熒光及Western-blot檢測(cè)GSCs中ADAM17蛋白的表達(dá);利用RNA干擾(ShRNA)技術(shù)阻滯或ADAM17特異性增強(qiáng)劑(PMA)強(qiáng)化ADAM17mRNA及蛋白表達(dá)，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各干預(yù)組GSCs遷移和侵襲性的變化;同時(shí)利用Western

18、 blot檢測(cè)檢測(cè)ADAM17、EGFR/p-EGFR、AKT/p-AKT、ERK/p-ERK的蛋白表達(dá)變化。用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果相對(duì)于CD133-細(xì)胞，GSCs高表達(dá)ADAM17，ADAM17 ShRNA能有效抑制GSCs的遷移和侵襲，反之ADAM17特異性增強(qiáng)劑(PMA)能增強(qiáng)GSCs的遷移和侵襲（P＜0.05或P＜0.01）。AD