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1、背景: 血漿同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平升高已被證明是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,但致病機(jī)制尚未完全明了。目前認(rèn)為,同型半胱氨酸硫內(nèi)酯(Homocysteine thiolactone,HTL)作為同型半胱氨酸的代謝產(chǎn)物之一,可以通過(guò)修飾蛋白表面的賴氨酸殘基,破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并損傷其生理活性,形成HTL復(fù)合物。研究表明,在Hcy致冠心病過(guò)程中HTL復(fù)合物發(fā)揮了重要作用,可能是Hcy致冠心病的關(guān)鍵因素之一,因此近
2、年來(lái)HTL復(fù)合物作為心血管疾病的一個(gè)標(biāo)志物而日益受到關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)臨床上普遍開(kāi)展的檢測(cè)方法為檢測(cè)總同型半胱氨酸(tHcy)含量,尚未有準(zhǔn)確測(cè)定同型半胱氨酸硫內(nèi)酯復(fù)合物的方法。國(guó)外近年來(lái)開(kāi)展了用HPLC方法測(cè)定HTL復(fù)合物的方法,但價(jià)格較高,難以普及。 本研究首先建立穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)便易行的測(cè)定HTL復(fù)合物的方法,通過(guò)檢測(cè)血漿HTL復(fù)合物水平系統(tǒng)地探究HTL復(fù)合物與冠心病的關(guān)系,以期明確HTL復(fù)合物是否為中國(guó)人群冠心病發(fā)病的危險(xiǎn)因素。
3、然后應(yīng)用多聚酶鏈限制性片斷多態(tài)反應(yīng)技術(shù)對(duì)paraoxonase-2進(jìn)行基因分型,并探討paraoxonase-2基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系,為進(jìn)一步深入廣泛研究提供有益線索。 材料與方法: 1.通過(guò)用HTL體外修飾白蛋白,得到HTL復(fù)合物抗原,并用HTL復(fù)合物抗原免疫新西蘭大白兔,得到抗HTL復(fù)合物抗體,依據(jù)Eric Ferguson及Yosltinori Uji等的方法學(xué)描述,建立競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法以檢測(cè)血漿HTL-H
4、SA復(fù)合物。 2.樣本組:選擇2002年1月至2003年12月我院心內(nèi)科住院的患者共254例,經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)患冠心??;對(duì)照組:選擇正常查體人群308例為對(duì)照組。上述所有入選對(duì)象均無(wú)肝、腎、腫瘤、血液、風(fēng)濕病等疾病,已知其它原因的心臟病亦被排除,調(diào)查內(nèi)容包括冠心病史、高脂血癥史、吸煙史及飲酒史等。計(jì)算體重指數(shù)(BMI),采用ELISA方法檢測(cè)HTL復(fù)合物,采用HPLC的方法進(jìn)行Hcy的測(cè)定,采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血糖、生化、
5、血脂等血生化指標(biāo)的測(cè)定。 3.通過(guò)低滲溶血法分離白細(xì)胞,鹽氯法提取人基因組DNA,應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)分析Paraoxonase-2基因311位Cys-Ser多態(tài)性。 4.采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料以Mean±SD表示,各組間數(shù)據(jù)的比較依據(jù)資料的性質(zhì),采用t檢驗(yàn)、x2檢驗(yàn)。采用多元逐步logistic回歸分析、簡(jiǎn)單直線相關(guān)分析及多元線性回歸分析。等位
6、基因確認(rèn)符合Hardy-Weinberg平衡。 研究結(jié)果: 1.得到HTL修飾的人血清白蛋白及兔血清白蛋白。并通過(guò)DTNB法及TNBS方法鑒定修飾結(jié)果。TNBS方法顯示BSA及RSA表面約20%的賴氨酸殘基被HTL修飾。 2.得到抗HTL復(fù)合物多抗且抗體的工作濃度約為1:500。采用了競(jìng)爭(zhēng)性固相ELISA法鑒定所得抗體是特異性抗HTL復(fù)合物的抗體,且HTL復(fù)合物的組分包括HTL修飾血中存在的多種蛋白形成的相應(yīng)HT
7、L復(fù)合物,如HSA、HB、LDL及HDL等。 3.建立ELISA方法測(cè)定HTL復(fù)合物含量。本方法特異性良好,特異性抗HTL修飾后蛋白即HTL復(fù)合物;靈敏度良好,檢測(cè)范圍在12.5-200u/ml之間,若以正常人群90%以上的值37.57 u/ml確定為正常上限值,此點(diǎn)位于曲線中部,靈敏度最高。精密度測(cè)定結(jié)果顯示:批內(nèi)變異系數(shù)為6.4%,批間變異系數(shù)為8.9%,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。 4.冠心病組及其各組分與對(duì)照組HTL復(fù)合物水
8、平的比較:冠心病組HTL復(fù)合物水平明顯高于對(duì)照組(40.65±10.87 u/ml vs.30.58±10.20 u/ml,P<0.01),多元logistic回歸分析顯示,HTL復(fù)合物對(duì)冠心病的相對(duì)危險(xiǎn)度(OR)為7.34,(95%可信區(qū)間4.020~13.406,P<0.01)。HTL復(fù)合物與冠狀動(dòng)脈血管堵塞程度具有直線關(guān)系:1、2和3支病變分別為:35.59±10.34 units/ml(n=76);41.88±8.83(n=70
9、)and 43.13±11.47(n=108)(r=0.174,P<0.01)。 5.冠心病組paraoxonase-2基因311位點(diǎn)C等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(0.232 vs.0.149,P=0.017),CC基因型的頻率為7.48%,顯著高于對(duì)照組1.62%(OR)為4.367(95%可信區(qū)間:1.178 to 16.191,P<0.01)。 結(jié)論: HTL復(fù)合物可能是預(yù)測(cè)心血管病事件的生化指標(biāo),檢測(cè)血漿
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