冠心病與心肌重塑的新的危險因素：同型半胱氨酸硫內(nèi)酯復合物及其代謝酶基因多態(tài)性與生長分化因子15的基因多態(tài)性.pdf

1、背景： 血漿同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)水平升高已被證明是冠心病的獨立危險因素，但致病機制尚未完全明了。目前認為，同型半胱氨酸硫內(nèi)酯(Homocysteine thiolactone，HTL)作為同型半胱氨酸的代謝產(chǎn)物之一，可以通過修飾蛋白表面的賴氨酸殘基，破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構并損傷其生理活性，形成HTL復合物。研究表明，在Hcy致冠心病過程中HTL復合物發(fā)揮了重要作用，可能是Hcy致冠心病的關鍵因素之一，因此近

2、年來HTL復合物作為心血管疾病的一個標志物而日益受到關注。目前國內(nèi)臨床上普遍開展的檢測方法為檢測總同型半胱氨酸(tHcy)含量，尚未有準確測定同型半胱氨酸硫內(nèi)酯復合物的方法。國外近年來開展了用HPLC方法測定HTL復合物的方法，但價格較高，難以普及。 本研究首先建立穩(wěn)定可靠、簡便易行的測定HTL復合物的方法，通過檢測血漿HTL復合物水平系統(tǒng)地探究HTL復合物與冠心病的關系，以期明確HTL復合物是否為中國人群冠心病發(fā)病的危險因素。

3、然后應用多聚酶鏈限制性片斷多態(tài)反應技術對paraoxonase-2進行基因分型，并探討paraoxonase-2基因多態(tài)性與冠心病的關系，為進一步深入廣泛研究提供有益線索。 材料與方法： 1.通過用HTL體外修飾白蛋白，得到HTL復合物抗原，并用HTL復合物抗原免疫新西蘭大白兔，得到抗HTL復合物抗體，依據(jù)Eric Ferguson及Yosltinori Uji等的方法學描述，建立競爭性ELISA方法以檢測血漿HTL-H

4、SA復合物。 2.樣本組：選擇2002年1月至2003年12月我院心內(nèi)科住院的患者共254例，經(jīng)冠狀動脈造影證實患冠心病；對照組：選擇正常查體人群308例為對照組。上述所有入選對象均無肝、腎、腫瘤、血液、風濕病等疾病，已知其它原因的心臟病亦被排除，調(diào)查內(nèi)容包括冠心病史、高脂血癥史、吸煙史及飲酒史等。計算體重指數(shù)(BMI)，采用ELISA方法檢測HTL復合物，采用HPLC的方法進行Hcy的測定，采用全自動生化分析儀進行血糖、生化、

5、血脂等血生化指標的測定。 3.通過低滲溶血法分離白細胞，鹽氯法提取人基因組DNA，應用多聚酶鏈反應-限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性技術(PCR-RFLP)分析Paraoxonase-2基因311位Cys-Ser多態(tài)性。 4.采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以Mean±SD表示，各組間數(shù)據(jù)的比較依據(jù)資料的性質(zhì)，采用t檢驗、x2檢驗。采用多元逐步logistic回歸分析、簡單直線相關分析及多元線性回歸分析。等位

6、基因確認符合Hardy-Weinberg平衡。 研究結(jié)果： 1.得到HTL修飾的人血清白蛋白及兔血清白蛋白。并通過DTNB法及TNBS方法鑒定修飾結(jié)果。TNBS方法顯示BSA及RSA表面約20％的賴氨酸殘基被HTL修飾。 2.得到抗HTL復合物多抗且抗體的工作濃度約為1：500。采用了競爭性固相ELISA法鑒定所得抗體是特異性抗HTL復合物的抗體，且HTL復合物的組分包括HTL修飾血中存在的多種蛋白形成的相應HT

7、L復合物，如HSA、HB、LDL及HDL等。 3.建立ELISA方法測定HTL復合物含量。本方法特異性良好，特異性抗HTL修飾后蛋白即HTL復合物；靈敏度良好，檢測范圍在12.5-200u/ml之間，若以正常人群90％以上的值37.57 u/ml確定為正常上限值，此點位于曲線中部，靈敏度最高。精密度測定結(jié)果顯示：批內(nèi)變異系數(shù)為6.4％，批間變異系數(shù)為8.9％，實驗重復性良好。 4.冠心病組及其各組分與對照組HTL復合物水

8、平的比較：冠心病組HTL復合物水平明顯高于對照組(40.65±10.87 u/ml vs.30.58±10.20 u/ml，P<0.01)，多元logistic回歸分析顯示，HTL復合物對冠心病的相對危險度(OR)為7.34，(95％可信區(qū)間4.020～13.406，P<0.01)。HTL復合物與冠狀動脈血管堵塞程度具有直線關系：1、2和3支病變分別為：35.59±10.34 units/ml(n=76)；41.88±8.83(n=70

9、)and 43.13±11.47(n=108)(r=0.174，P<0.01)。 5.冠心病組paraoxonase-2基因311位點C等位基因頻率顯著高于對照組(0.232 vs.0.149，P=0.017)，CC基因型的頻率為7.48％，顯著高于對照組1.62％(OR)為4.367(95％可信區(qū)間：1.178 to 16.191，P<0.01)。 結(jié)論： HTL復合物可能是預測心血管病事件的生化指標，檢測血漿