ERCC1、MT1H基因表達與晚期胃癌鉑類繼發(fā)耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、胃癌是全世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一,胃癌的發(fā)病率及死亡率均較高。胃癌早期診斷率低,缺乏特異性早期表現(xiàn),多數(shù)患者確診時已屬中晚期,失去手術(shù)根治機會,預(yù)后極差,通常5年生存率不超過20％。鉑類及氟尿嘧啶類是胃癌新輔助化療、術(shù)后輔助化療及進展期胃癌姑息治療等最常見的藥物。由于存在腫瘤細胞耐藥,尤其是腫瘤多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR),嚴重影響了化療療效及預(yù)后。如何提高胃癌化療藥物的敏感性,提高化療療效是目前臨床

2、關(guān)注的焦點。
　　 腫瘤細胞耐藥與腫瘤細胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)能力差異及細胞解毒體系巰基分子的過量表達有關(guān)。DNA損傷主要通過核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair,NER)途徑修復(fù),而切除修復(fù)交叉互補基因1(excision repair cross-complementing gene1,ERCC1)在NER中起關(guān)鍵作用。ERCC1低表達可以使腫瘤的發(fā)生率增加,ERCC1過表達可對抗鉑類的抗瘤效果。

3、ERCC1表達增強所致。DNA損傷修復(fù)能力的增強是腫瘤細胞對鉑類耐藥的一大重要因為。細胞內(nèi)含巰基蛋白以金屬硫蛋白(metallothionein,MT)為主,MT是一類低分子量、富含半胱氨酸、可被金屬誘導(dǎo)的特異蛋白質(zhì)。MT和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化,參與腫瘤耐藥,影響腫瘤的治療和預(yù)后。人MT基因包括10個功能性基因和7個非功能性基因。其中金屬硫蛋白1H(MT1H)是MT功能性基因之一,目前關(guān)于MT1H的資

4、料較少?，F(xiàn)在研究較多的是腫瘤組織中ERCC1、MT。蛋白和mRNA的表達與化療耐藥及療效的關(guān)系,而外周血中ERCC1、MT1H的研究較少。鑒于此,本課題首先研究人胃腺癌SGC-7901細胞中ERCC1、MT1H的表達在順鉑繼發(fā)耐藥中的作用,然后探討存在循環(huán)腫瘤細胞的晚期胃癌患者鉑類化療前后外周血中ERCC1、MT1H的表達與鉑類繼發(fā)耐藥的相關(guān)性及有關(guān)機制。
　　 第一部分：
　　 目的:研究順鉑對人胃腺癌SGC-7901

5、細胞株的殺傷作用及順鉑作用人胃腺癌SGC-7901細胞后ERCC1、MT1H表達的變化,探討ERCC1、MT1H的表達與順鉑繼發(fā)耐藥的關(guān)系。
　　 方法:MTT法檢測順鉑對人胃腺癌SGC-7901細胞的增殖抑制率；采用半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測不同時間、不同濃度順鉑作用后人胃腺癌SGC-7901細胞中ERCC1、MT1H的表達情況。統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行t檢驗,半定量結(jié)果用x±s表示,P<

6、0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.隨著DDP濃度的增加,對人胃腺癌SGC-7901細胞的抑制作用逐漸增強,24小時IC50=14μmol/L,48小時IC50=11μmol/L。
　　 2.DDP濃度為2.5μmol/L時,人胃腺癌SGC-7901細胞中ERCC1、MT1H表達開始增高,隨著濃度的增加,其表達也增高,DDP濃度為40μmol/L時其表達最高,分別為對照組的2.19和2.82倍,與對照

7、組比較,差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001、P=0.005)。
　　 3.20μmol/LDDP作用12小時后人胃腺癌SGC-7901細胞中ERCC1、MT1H的表達開始增高,隨著作用時間的延長,其表達也增高,順鉑作用72小時其表達最高,分別為對照組的2.71和3.15倍,與對照組相比,差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005、P=0.001)。
　　 結(jié)論:順鉑對人胃腺癌SGC-7901細胞的抑制作用呈劑量依賴性。隨著DDP

8、濃度的增加及作用時間的延長,人胃腺癌SGC-7901細胞中ERCC1、MT1H的表達增加,推測ERCC1、MT1H可能參與了順鉑的繼發(fā)耐藥。
　　 第二部分：
　　 目的:研究存在循環(huán)腫瘤細胞的晚期胃癌患者鉑類化療前后外周血中ERCC1、MT1H的表達情況,進一步探討ERCC1、MT1H的表達與胃癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及與鉑類繼發(fā)耐藥的相關(guān)性。
　　 方法:收集162例經(jīng)病理學(xué)或細胞學(xué)確診的晚期胃癌患者化療前外周

9、血(15ml),通過8um孔徑,47mm直徑的濾膜過濾外周血(7.5ml),初步篩選分離腫瘤細胞,用細胞角蛋白8(CK8)抗體、二抗、白細胞共同抗原(CD45)抗體染色并用核酸染料4,6二脒基苯基吲哚(DAPI)染色細胞核后用激光掃描細胞計數(shù)儀分析,選出DAPI+CK8+45-,再根據(jù)腫瘤細胞細胞核形態(tài)、大小最終確認腫瘤細胞。選出存在循環(huán)腫瘤細胞的晚期胃癌患者,采用半定量RT-PCR檢測其含鉑方案化療前后外周血(7.5ml)中ERCC1

10、、MT1H的表達。患者完成2個周期化療后按照RECIST標準將患者分為有效組和無效組,比較化療前后ERCC1、MT1H的表達的變化。統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行t檢驗、x2檢驗,半定量結(jié)果用x±s表示,P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.激光掃描細胞計數(shù)儀掃描后應(yīng)用icys3.3軟件數(shù)據(jù)包進行分析:選出DAPI+CK8+CD45-細胞且細胞核大、深染,呈高核漿比,胞漿內(nèi)CK8抗體染色呈典型

11、的環(huán)形或帽形,則確定為循環(huán)腫瘤細胞。162例患者晚期胃癌患者檢出循環(huán)腫瘤細胞的有108例,檢出率為66.67％。與健康對照組(檢出率為0)相比,有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。
　　 2.108例晚期胃癌含鉑方案化療后,無完全緩解(CR)病例,部分緩解(PR)40例,穩(wěn)定(SD)38例,進展(PD)30例,總有效率(CR+PR)為37.04％。
　　 3.108例晚期胃癌患者化療前外周血中ERCC1的表達與年齡、性別

12、、TNM分期無關(guān)(P>0.05),而與分化程度相關(guān)(P=0.002)。108例晚期胃癌患者中有76例外周血中ERCC1表達陽性,陽性率為70.37％?；熀驟RCC1表達水平明顯高于化療前(P=0.000)。有效組與無效組化療前ERCC1表達水平的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.171)；有效組與無效組化療后ERCC1表達水平的差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000);有效組化療前后ERCC1表達水平的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.105)；無效組化療

13、前后ERCC1表達水平的差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。
　　 4.108例晚期胃癌患者化療前外周血中MT1H的表達與年齡、性別、TNM分期無關(guān)(P>0.05),而與分化程度有關(guān)(P=0.014)。108例晚期胃癌患者中有94例外周血中MT1H表達陽性,陽性率為87.04％?；熀驧T1H表達水平明顯高于化療前(P=0.037)。有效組與無效組化療前、有效組與無效組化療后MT1H表達水平的差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.199、

14、P=0.118),有效組化療前后、無效組化療前后MT1H表達水平的差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.109、P=0.082)。
　　 結(jié)論:
　　 1.膜濾過聯(lián)合激光掃描細胞計數(shù)儀檢測晚期胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞的方法特異性高,可有效檢測晚期胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞,為腫瘤的早期診斷提供了一種新的簡便有效的方法。
　　 2.晚期胃癌患者外周血中ERCC1、MT1H的表達與腫瘤的分化程度密切相關(guān),提示ERCC1、MT1H可能參與