以siRNA表達(dá)載體介導(dǎo)的RNA干涉法建立人細(xì)胞色素b5還原酶缺陷的細(xì)胞模型.pdf

1、NADH-細(xì)胞色素b5還原酶(簡(jiǎn)稱b5R)是一種具有重要生理功能的氧化還原酶類，以胞漿可溶型和膜結(jié)合型兩種形式存在于體內(nèi)。b5R基因突變將導(dǎo)致隱性先天性高鐵血紅蛋白血癥(RCM)。 本課題利用RNA干涉(RNAi)技術(shù)，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)在線軟件設(shè)計(jì)并合成兩條靶向人b5RmRNA的siRNA模板片段，分別將其克隆至經(jīng)過(guò)改建、帶有neo基因的pSilencer1.0-U6載體上，構(gòu)建成siRNA真核表達(dá)載體pSib5R-1和pSib5R-2

2、。重組載體通過(guò)酶切和DNA直接測(cè)序鑒定。分別將兩種重組質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肺成纖維細(xì)胞和BEL-7402肝癌細(xì)胞株，半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR分析b5RmRNA的表達(dá)抑制效率。結(jié)果顯示，pSib5R-1對(duì)兩種細(xì)胞b5R基因的表達(dá)無(wú)明顯影響，pSib5R-2對(duì)成纖維細(xì)胞b5RmRNA的抑制率達(dá)81.7％，對(duì)BEL-7402細(xì)胞b5RmRNA的抑制率達(dá)60％，說(shuō)明兩種細(xì)胞b5R基因的表達(dá)均可被pSib5R-2介導(dǎo)的RNA

3、干涉有效抑制。 對(duì)pSib5R-1、pSib5R-2轉(zhuǎn)染的BEL-7402細(xì)胞，采用G418進(jìn)行篩選，共獲得共獲得18個(gè)細(xì)胞克?。浩渲锌蛰d體5個(gè)，pSib5R-15個(gè)，pSib5R-28個(gè)。經(jīng)PCR鑒定證實(shí)，各個(gè)克隆均穩(wěn)定整合有重組載體或空載體。對(duì)各穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆在b5RmRNA水平、酶活性、酶含量等方面進(jìn)行干涉效果的鑒定，結(jié)果顯示，pSib5R-2轉(zhuǎn)染的克隆中有兩個(gè)克隆b5RmRNA抑制率達(dá)48.2％和56.2％；酶活性抑

4、制率為38.4％和48.5％；酶含量也有明顯降低。對(duì)b5R酶缺陷的細(xì)胞克隆采用MTT法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)b5R酶缺陷沒(méi)有改變細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。采用MTT法，通過(guò)不同濃度的絲裂霉素以及絲裂霉素處理后的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)b5R酶缺陷和正常的BEL-7402細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)b5R酶缺陷并沒(méi)有降低絲裂霉素抑制BEL-7402細(xì)胞的敏感性。 本研究成功構(gòu)建了b5RsiRNA表達(dá)載體，建立b5R酶缺陷的BEL-7402的細(xì)胞模型