典型三苯甲烷還原酶的細胞表面展示及新型雙功能染料還原酶的挖掘和底物識別機制研究.pdf

1、印染廢水水量大、水溫高、成分復雜等特性對現(xiàn)有的生物處理方法提出了嚴峻的挑戰(zhàn)，因此尋找高效、穩(wěn)定、低成本、廣譜的印染廢水處理方案成為了當務之急。本研究旨在通過構(gòu)建染料高效降解酶的表面展示系統(tǒng)，既可以解決染料跨膜運輸?shù)碾y題，又可以降低廢水處理成本，為染料降解酶的實際應用提供理論基礎。同時本研究通過基因組挖掘獲得了一個可以同時降解三苯甲烷和偶氮染料的還原酶，并部分闡明了其底物識別機制，對具有底物廣譜性的染料降解酶類的改造具有重要意義。論文主要

2、研究結(jié)果如下:
　　1)重組三苯甲烷還原酶CsTMR為同源二聚體，最適pH和溫度分別為8.5和55℃，在45℃以下處理半小時后保持穩(wěn)定，在5.0-10.0的pH范圍內(nèi)處理后可以保持其初始活性的50％以上?？傮w而言，該酶活性和穩(wěn)定性較好，適合作為固定化或表面展示的對象來為染料廢水的降解研究提供新的思路。
　　2)以來自Pseudomonas borealis的冰晶核蛋白N端(InaPb-N)作為錨定蛋白，構(gòu)建CsTMR大腸桿菌

3、表面展示系統(tǒng)。約有85％的外源蛋白被成功展示在大腸肝菌外膜上，表面展示CsTMR對孔雀石綠的脫色速率達到了640μtmol min-1 g-1DWC。表面展示酶的穩(wěn)定性比游離純酶顯著提高，特別是長期穩(wěn)定性。在我們進一步嘗試構(gòu)建輔酶再生體系，利用InaPB-N介導的葡萄糖脫氫酶DS255表面展示系統(tǒng)時，在胞外檢測不到GDH活性，說明DS255沒有被成功展示。
　　3)利用cotG作為分子載體構(gòu)建枯草芽孢桿菌芽孢表面展示系統(tǒng)，將CsT

4、MR和DS255成功展示在芽孢表面。與純酶相比，兩種表面展示的蛋白對pH和溫度的耐受范圍更廣，且具有更好的穩(wěn)定性。利用表面展示的CsTMR和DS255的芽孢，作為全細胞催化劑構(gòu)建輔酶再生體系，根據(jù)不同的參數(shù)得出整個體系需要較高比例的芽孢展示DS255才能夠滿足CsTMR對于NADH的需求，從而達到較高的降解速率。
　　4)以CsTMR氨基酸序列為探針，通過數(shù)據(jù)庫挖掘，從Geobacillusthermoglucosidasius

5、C56-YS93的得到一個可能編碼三苯甲烷還原酶的基因，根據(jù)其底物特異性將其命名為GtAZR。重組GtAZR在pH5.5和40℃條件下具有最大活性，在低于65℃的溫度下保持穩(wěn)定，同時它也具有較廣的pH耐受范圍。該酶對有機溶劑有非常高的耐受性。此外，GtAZR底物譜較廣，能同時降解三苯甲烷和偶氮類染料。GtZAR強大的穩(wěn)定性和底物廣譜性使它在處理實際混合染料廢水中有著極好的應用前景。
　　5)通過同源建模、分子對接、分子動力學模擬和