重組人MG53蛋白對(duì)造影劑急性腎損傷的保護(hù)作用.pdf

1、近年來(lái)，隨著介入治療、多層螺旋計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)和全新的三維重建技術(shù)的廣泛應(yīng)用，含碘造影劑的使用更加頻繁，造影劑急性腎損傷(Contrast-induced acute kidneyinjury，CI-AKI)或造影劑腎病(Contrast-induced nephropathy，CIN)的患病率越來(lái)越高。臨床研究資料顯示，在醫(yī)源性急性腎損傷的排名中CI-AKI已經(jīng)高居第三位，其病死率高達(dá)34.0％。正常人群中造影劑腎病的發(fā)病率并不高，但

2、是在高風(fēng)險(xiǎn)人群中，比如伴有糖尿病、慢性腎損傷或高血壓等疾病的患者中，其發(fā)生率會(huì)有很大程度的增加。目前臨床上尚缺乏有效措施逆轉(zhuǎn)CI-AKI的病程進(jìn)展。如何預(yù)防和減輕腎臟CI-AKI，一直是腎臟保護(hù)中的重要課題，逐漸成為熱點(diǎn)被臨床和科研所關(guān)注。
　　Mitsugumin53(MG53)是新發(fā)現(xiàn)的一種主要由肌肉分泌的蛋白，屬于Tripartitemotif（TRIM）家族，在心肌和骨骼肌中表達(dá)豐富。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在心肌的急性缺血再灌注損傷中

3、，MG53可以通過(guò)激活RISK信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用。體內(nèi)及體外研究表明，外源性給予重組人MG53蛋白(rhMG53)對(duì)腎臟的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腎臟組織中MG53含量較為豐富，且MG53敲除的小鼠會(huì)在20周出現(xiàn)腎功能不全，表明MG53對(duì)于維持正常腎臟功能起到非常重要的作用。但是MG53對(duì)于造影劑急性腎損傷是否有保護(hù)作用目前還不清楚，因此，本研究建立大鼠造影劑急性腎損傷模型，通過(guò)蛋白免疫印跡(western blot)

4、，TUNEL調(diào)亡細(xì)胞檢測(cè)法等技術(shù)，觀察造影劑急性腎損傷大鼠血清肌酐尿素氮濃度，肌酐清除率的改變，腎組織中Caspase-3的表達(dá)，凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，RISK通路中Akt、磷酸化Akt(p-Akt)GSK-3β及磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)的表達(dá)情況。探討MG53對(duì)大鼠造影劑急性腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床預(yù)防和防治腎損傷提供理論依據(jù)觀察。
　　目的:
　　研究rhMG53對(duì)大鼠造影劑急性腎損傷(Contrast-

5、induced acute kidneyinjury，CI-AKI)的影響，通過(guò)腎臟功能及病理的變化，腎臟組織凋亡情況等方面來(lái)探討rhMG53腎臟保護(hù)作用的藥理機(jī)制。
　　方法:
　　將24只10～12周齡SD大鼠[雌雄各半，體重(225±15)g]采用完全隨機(jī)分組方法分:正常對(duì)照組（Control組）、rhMG53組、造影劑組（CM組）、造影劑+rhMG53組（CM+rhMG53組）四組，每組6只。通過(guò)頸外靜脈插管的方法給

6、予吲哚美辛(Indomethacin)、一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)及碘普羅胺(Iopromide)建立造影劑腎損傷24h模型。Control組:分離皮下組織，暴露右側(cè)頸外靜脈，剪開(kāi)靜脈，插入導(dǎo)管，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)注入生理鹽水;rhMG53組:頸外靜脈插入導(dǎo)管，注入rhMG53，劑量為5mg/kg體重，其余時(shí)間點(diǎn)注射與CM組相同劑量生理鹽水;CM組:頸外靜脈插入導(dǎo)管，注入吲哚美辛（溶于Dmso，10mg/kg體重），15分鐘后注入L-N

7、AME（溶于生理鹽水，10mg/kg體重），15分鐘后注入碘普羅胺注射液（1600mg/kg體重）;CM+rhMG53組:在造模型15min前給予rhMG53(5mg/kg)干預(yù)，其余步驟同CM組。造模成功后，術(shù)后24h留取各組大鼠腎臟組織及血清，通過(guò)代謝籠留取24h尿液，分別檢測(cè)SCR、BUN、UCR、CCR，腎臟組織中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3、Caspase-3Akt、磷酸化Akt(p-Akt) GSK-3β及

8、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡情況，HE染色后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察病理?yè)p傷情況，并通過(guò)腎間質(zhì)充血、蛋白管型和細(xì)胞壞死等三個(gè)方面進(jìn)行腎臟損傷的病理評(píng)分。
　　結(jié)果:
　　1.rhMG53能改善造影劑造成的腎臟急性損傷。我們建立了SD大鼠造影劑急性腎損傷(CI-AKI)模型，給予rhMG53預(yù)處理后觀察是否有保護(hù)作用。結(jié)果顯示:rhMG53單獨(dú)處理組與Control組腎功能指標(biāo)及腎臟病理

9、評(píng)分的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CI-AKI后，Scr、BUN明顯升高，CCr顯著降低，表明腎臟功能損傷;然后我們通過(guò)腎臟病理切片（HE染色）發(fā)現(xiàn)，腎臟損傷的主要部位是皮髓質(zhì)交界區(qū)，在該損傷區(qū)域出現(xiàn)較多的小管上皮細(xì)胞脫落、壞死，炎癥浸潤(rùn)，部分管腔出現(xiàn)蛋白管型，腎間質(zhì)及小管中有嚴(yán)重的血管充血及出血點(diǎn)。在給予rhMG53預(yù)處理后，血肌酐、尿素氮明顯降低，肌酐清除率升高，腎臟病理?yè)p傷減輕，病理評(píng)分降低，病理切片顯示蛋白管型、血管充血及出血點(diǎn)減少，細(xì)

10、胞壞死較少。通過(guò)腎功能指標(biāo)和病理組織學(xué)評(píng)分初步驗(yàn)證rhMG53對(duì)造影劑急性腎損傷有保護(hù)作用。
　　2.rhMG53能減少造影劑急性腎損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。為了檢測(cè)CI-AKI中大鼠腎臟組織凋亡的情況，我們分別運(yùn)用TUNEL及凋亡相關(guān)蛋白免疫印跡的方法來(lái)檢測(cè)。通過(guò)TUNEL法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Control組和rhMG53單獨(dú)處理組中腎臟組織中僅見(jiàn)極少散在的凋亡細(xì)胞，CM組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加主要分布在腎臟組織的皮髓質(zhì)交界區(qū)，CM+

11、rhMG53組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞與CM組比較明顯降低;在凋亡蛋白的免疫印跡中，CM組的Caspase-3剪切體（Cleaved Caspase-3）比Control組有明顯升高，給予rhMG53預(yù)保護(hù)后，Cleaved Caspase-3能夠明顯降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了rhMG53能夠減少腎臟細(xì)胞凋亡。
　　3.rhMG53通過(guò)再灌注損傷補(bǔ)救激酶(RISK)通路發(fā)揮對(duì)造影劑急性腎損傷的保護(hù)作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在心臟缺血再灌注損傷中，

12、MG53能夠與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3 kinase，PI3K)的p85亞基結(jié)合，使其下游的Akt和GSK-33的磷酸化增加，激活RISK信號(hào)通路，從而減輕心肌梗死的嚴(yán)重程度。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)RISK信號(hào)通路中的重要分子Akt和GSK-33磷酸化程度，發(fā)現(xiàn)在CM組中磷酸化的AKT(p-AKT)和GSK-3β(p-GSK-3β)與對(duì)照組比較明顯降低，給予rhMG53保護(hù)后，能

13、夠增加p-AKT和p-GSK-3β的表達(dá)，這一結(jié)論表明，rhMG53可以通過(guò)激活RISK信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)造影劑急性腎損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rhMG53能夠保護(hù)造影劑急性腎損傷，改善腎功能，減輕病理?yè)p傷，同時(shí)能夠減少腎臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，rhMG53能夠增加RISK通路中AKT和GSK-3β的磷酸化程度。表明rhMG53可以通過(guò)激活R