SD大鼠脊髓全橫斷后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中NT-3和TrkC的表達(dá)變化.pdf

1、背景:
　　 脊髓損傷是一嚴(yán)重創(chuàng)傷,常規(guī)的治療效果不佳,使相當(dāng)一部分病人遺留運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、膀胱及直腸功能障礙。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是神經(jīng)損傷修復(fù)與功能重建的必要物質(zhì)基礎(chǔ),從內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT-3)及其受體TrkC表達(dá)的相關(guān)分子機(jī)制及脊髓可塑性入手,探索促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的新策略是當(dāng)前國(guó)際神經(jīng)科學(xué)界研究的重要內(nèi)容之一。
　　 目的:
　　 研究成年SD大鼠脊髓全橫斷后損傷位點(diǎn)頭尾側(cè)及其相聯(lián)系的陽(yáng)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中NT-3及

2、其受體TrkC表達(dá)的時(shí)相變化,探討內(nèi)源性NT-3及TrkC在脊髓損傷修復(fù)中的內(nèi)源性作用機(jī)制及其與脊髓可塑性的關(guān)系。
　　 方法:
　　 取健康成年SD大鼠(200-220克)42只,隨機(jī)分成6組:每組7只,其中一組為假手術(shù)對(duì)照組,余為脊髓全橫斷模型組。模型動(dòng)物分別于手術(shù)后1天、3天、7天、14天、28天,取損傷節(jié)段上、下各1cm的脊髓4段(大約為T(mén)8-T11脊髓節(jié)段)和雙側(cè)大腦運(yùn)動(dòng)皮層、中腦紅核節(jié)段,共7處組織標(biāo)本。其中

3、,各組中3只用于免疫組化染色以了解NT-3及TrkC的原位分布,2只用于WesternBlot檢測(cè)NT-3及TrkC的蛋白含量,2只用于RT-PCR檢測(cè)NT-3及TrkC的基因表達(dá)水平。各組大鼠在存活期間均行后肢BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。用于免疫組化的大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后,4％多聚甲醛經(jīng)升主動(dòng)脈灌注后取材,組織后固定、入20％、25％、30％蔗糖溶液梯度脫水沉底后制作20μm連續(xù)冰凍切片,以NT-3及TrkC抗體行免疫組化SP三步法DA

4、B染色和熒光染色并作對(duì)照。光鏡和熒光顯微鏡下觀察免疫陽(yáng)性反應(yīng)物的正常原位分布情況,觀測(cè)并計(jì)數(shù)假手術(shù)和脊髓全橫斷損傷后,成年SD大鼠脊髓腹角和大腦皮質(zhì)前運(yùn)動(dòng)區(qū)NT-3及TrkC陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化、分布及亞細(xì)胞定位。用于western blot和RT-PCR檢測(cè)的大鼠麻醉后,于活體下快速取材,部位同上,沖洗后冰浴下勻漿,將提取的蛋白離心、分裝。用于RT-PCR檢測(cè)的活取組織加入TRIzol作RNA抽提。電泳及免疫印跡檢測(cè)后,利用凝膠成像

5、系統(tǒng)分析各雜交帶的光密度值及灰度值的時(shí)空變化。結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)果:
　　 1.Western blotting特異性的識(shí)別分子量13.6Kda和145Kda處的條帶對(duì)應(yīng)NT-3和TrkC的分子量,置換試驗(yàn)、陰性對(duì)照試驗(yàn)均為陰性。
　　 2.免疫組化技術(shù)觀察結(jié)果:(1)運(yùn)用免疫組化技術(shù),觀察到不同強(qiáng)度的NT-3和TrkC免疫陽(yáng)性產(chǎn)物廣泛分布于大

6、鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、中間神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。(2)通過(guò)Western blotting半定量,顯示NT-3在大鼠腦干、海馬區(qū)含量較豐富。
　　 3.假手術(shù)組和手術(shù)各組均觀察到NT-3和TrkC陽(yáng)性神經(jīng)元,NT-3定位于胞漿和胞核,胞核染色非常明顯,強(qiáng)于胞漿和神經(jīng)纖維；TrkC主要定位于陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿,假手術(shù)組極少見(jiàn)于神經(jīng)樹(shù)突或神經(jīng)末梢,未見(jiàn)于大腦運(yùn)動(dòng)皮層表達(dá)。脊髓損傷后,TrkC的陽(yáng)性核染明顯強(qiáng)化,強(qiáng)染色也見(jiàn)于一些樹(shù)狀分支和軸突,仍未

7、見(jiàn)于大腦中央運(yùn)動(dòng)皮層表達(dá)。
　　 4.脊髓損傷模型大鼠NT-3和TrkC的表達(dá)變化:(1)脊髓全橫斷損傷處上、下節(jié)段各組大鼠前角NT-3免疫陽(yáng)性神經(jīng)元平均數(shù)目比較均有顯著差異(P<0.001)；各手術(shù)組前角NT-3免疫陽(yáng)性神經(jīng)元平均數(shù)目均顯著低于假手術(shù)對(duì)照組(P<0.05)；由多重比較結(jié)果及圖38可以看出,手術(shù)1d組較對(duì)照組神經(jīng)元平均數(shù)目顯著下降,隨后呈逐漸上升趨勢(shì),一直到術(shù)后28d,仍保持較高增長(zhǎng)趨勢(shì)。各組SD大鼠脊髓全橫斷損

8、傷處上節(jié)段前角NT-3免疫陽(yáng)性神經(jīng)元與下節(jié)段前角NT-3免疫陽(yáng)性神經(jīng)元比較均無(wú)顯著差異(P=0.184～1.000)。(2)脊髓全橫斷損傷后,1d至7d的TrkC表達(dá)在損傷部位(T10、T11)和相鄰節(jié)段(T9、T12)對(duì)比假手術(shù)組表現(xiàn)下調(diào),在14d、28d表現(xiàn)為恢復(fù)至假手術(shù)組水平；TrkC的表達(dá)水平頭側(cè)明顯高于尾側(cè)；損傷節(jié)段又明顯高于相鄰節(jié)段。Western blotting半定量檢測(cè)未能觀察到TrkC蛋白在大腦運(yùn)動(dòng)皮層表達(dá)。(3)脊

9、髓損傷后TrkC的mRNA水平臨時(shí)變化模式與TrkC蛋白水平變化相似,1d至7d表現(xiàn)對(duì)比假手術(shù)組有明顯的減少,14d恢復(fù)至略高于假手術(shù)組的水平,對(duì)比假手術(shù)組在不同時(shí)點(diǎn)大腦運(yùn)動(dòng)皮層的表達(dá)均維持在一個(gè)相對(duì)低的水平。(4)NT-3和TrkC在脊髓灰質(zhì)的灰度值測(cè)試大致與免疫組化的變化趨勢(shì)相一致。
　　 5.大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)NT-3陽(yáng)性神經(jīng)元的變化趨勢(shì)同脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變化趨勢(shì)一致。
　　 6.BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分:對(duì)照組為21分

10、,1d、3d時(shí)呈完全性癱瘓狀態(tài)(0),從7d(0.57)起逐步恢復(fù),28d時(shí)最高(2.57)。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過(guò)對(duì)抗體的鑒定,證實(shí)本實(shí)驗(yàn)采用的兔抗NT-3多克隆抗體和鼠抗TrkC單克隆抗體是高度特異性抗體。
　　 2.NT-3和TrkC在成年SD大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元均有表達(dá),而NT-3和TrkC在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)既有重疊又存在差異,提示這一對(duì)配體和受體均可能參與了大鼠腦和脊髓神經(jīng)細(xì)胞的生理功能,但在