GDNF促進脊髓運動神經(jīng)元存活的PLCγ信號機制.pdf

1、目的：探討GDNF促脊髓運動神經(jīng)元存活和發(fā)育的PLCγ信號機制材料和方法：取胎齡14-15d的SD大鼠，分離出脊髓腹側(cè)組織，經(jīng)0.05％胰酶和終濃度為0.02％的EDTA37℃消化10min后吹打，經(jīng)6.8％甲泛葡胺分離液密度梯度離心，收集位于甲泛葡胺和培養(yǎng)液之間的大細胞層，后經(jīng)4％牛血清白蛋白除去細胞碎片，用完全培養(yǎng)基將試管底部的細胞重懸，種植在預(yù)先涂有多聚賴氨酸和層粘連蛋白的培養(yǎng)板或蓋玻片上。 培養(yǎng)3d后用星型膠質(zhì)細胞特異性

2、標記物GFAP鑒定星型膠質(zhì)細胞，神經(jīng)元特異性標記物NSE單克隆抗體鑒定脊髓神經(jīng)元；運動神經(jīng)元特異性標記物SMI-32、p75NTR單克隆抗體鑒定培養(yǎng)的運動神經(jīng)元。培養(yǎng)6d后成熟運動神經(jīng)元標記物ChAT單克隆抗體鑒定培養(yǎng)的成熟運動神經(jīng)元。 首先觀察細胞密度對細胞存活率的影響，計算各細胞密度組(1.5×104、3.0×104、4.5×104、6.0×104、7.5×104cell/cm2)培養(yǎng)24h后的細胞存活率。 觀察GD

3、NF對培養(yǎng)細胞的量效關(guān)系。培養(yǎng)24h后觀察對照組及不同GDNF濃度組(0.1、1、10、100ng/mL)的細胞存活率。 將培養(yǎng)的細胞分3個組：GDNF+U73122、GDNF+DMSO、GDNF組。GDNF濃度為以上試驗得出的理想濃度，根據(jù)相關(guān)文獻報道以及我們的預(yù)試驗選擇U73122濃度為2.5μmol/L，分別觀察培養(yǎng)24h后的細胞存活率。 每組各設(shè)三個復(fù)孔，在200×的倒置顯微鏡下，選擇96孔板的中央?yún)^(qū)域為計數(shù)范圍

4、，計數(shù)種植后4h的細胞總數(shù)，所有帶光暈，胞內(nèi)無空泡的細胞均計算在內(nèi)，記此時的細胞存活率為100％。計算培養(yǎng)24h后的細胞存活率，所有有光暈、并且突起長度大于兩倍胞體的細胞，胞體中無顆粒狀態(tài)良好者均計算在內(nèi)，共做三個批次。 細胞存活率用(_x)±s表示，用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行方差分析，p＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：培養(yǎng)3d后脊髓腹側(cè)細胞經(jīng)免疫組織化學(xué)鑒定為NSE、SMI-32、p75NTR陽性細胞，少數(shù)為

5、GFAP陽性細胞；培養(yǎng)6d的脊髓腹側(cè)細胞免疫組織化學(xué)鑒定為ChAT陽性神經(jīng)元。 當細胞密度為1.5×104、3×104、4.5×104、6×104、7.5×104cell/cm2時，細胞存活率分別為：27.67％±4.25％；36.87％±1.02％；40.97％±3.86％；46.11％±2.73％；46.61％±3.38％。1.5×104cell/cm2組的細胞存活率低于其余各組(3×104、4.5×104、6×104、7.

6、5×104cell/cm2)的細胞存活率，t值分別為9.2033、13.3000、18.4677、18.9367，p值均小于0.01；3×104cell/cm2密度組細胞存活率低于6×104、7.5×104cell/cm2組，t值分別為9.2433、9.7333，p值均小于0.01；其余各組間差異無顯著意義，p值均大于0.05。因而我們可以看出兩個高密度組(6×104、7.5×104cell/cm2)的細胞存活率較高，由于細胞密度為7.

7、5×104cell/cm2時，細胞間容易聚集成團，不利于細胞計數(shù)以及對細胞的觀察，因而我們選擇6×104cell/cm2作為GDNF量效實驗的基礎(chǔ)。 對照組及各GDNF濃度組(0、0.1、1、10、100ng/mL)的細胞存活率分別為：46.12％±2.73％；67.35％±1.77％；75.15％±2.80％；83.19％±1.07％；81.88％±2.12％。GDNF各濃度組(0.1、1、10、100ng/mL)的細胞率均高

8、于對照組，t值分別為21.2300、29.0367、37.0733、35.7667，p值均小于0.01。0.1ng/mL組的細胞存活率低于其余GDNF濃度組(1、10、100ng/mL)，t值分別為7.8067、15.8433、14.5367，p值均小于0.01；1ng/ml組的細胞存活率低于10、100ng/mLGDNF組的細胞存活率，t值分別為8.0367、6.7300，p值均小于0.01。而10ng/mL與100ng/mL組的細胞

9、存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，t=1.3067，p=0.483。因而我們選擇10ng/mL為促運動神經(jīng)元存活的濃度，進一步觀察U73122的干預(yù)作用。 GDNF+U73122，GDNF+DMSO及GDNF組細胞存活率分別為：31.87％±2.17％；79.39％±1.22％；81.38％±1.13％。GDNF+U73122組的細胞存活率均低于GDNF+DMSO組及GDNF組，t值分別為47.5200、49.5067，p均小于0.01。

10、而GDNF+DMSO組與GDNF組的細胞存活率差異無顯著性，t=1.9867，p=0.174。 結(jié)論：各GDNF濃度均可以促進胚胎脊髓運動神經(jīng)元的存活和生長，10ng/mL是理想的促脊髓運動神經(jīng)元存活濃度；U73122抑制GDNF促胚胎脊髓運動神經(jīng)元存活的作用，提示PLCγ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能是GDNF促脊髓運動神經(jīng)元存活的信號通路之一；本試驗成功建立體外培養(yǎng)脊髓運動神經(jīng)元的模型，培養(yǎng)時選擇胎齡14-15d的大鼠、聯(lián)合多聚賴氨酸和層