禽波氏桿菌外膜蛋白的提取及免疫原性的研究.pdf

1、禽波氏桿菌病是由禽波氏桿菌(Bordetella avium)引起家禽的一種高度接觸性傳染病。我國最早是由朱瑞良等在1990年初發(fā)現的，該病主要引起雞胚死亡、孵化率降低和雛雞急性死亡及成年雞的眼炎等。據報道該病在不同地區(qū)的感染率為10％～50％，患病雞群生長遲緩，飼料報酬低，給養(yǎng)雞業(yè)造成了較大的經濟損失。 近年來，細菌細胞膜中的一種重要組成成分外膜蛋白(outer-membrane-protein，OMP)的免疫作用越來越受到科

2、技人員的關注，并進行了研究。實驗證明，OMP具有良好的免疫原性，不僅可刺激體液免疫，而且也可刺激細胞免疫作用。盡管我們課題組曾經研究過禽波氏桿菌全菌苗的免疫效果，但由于全菌中與免疫無關的成分太多，可能影響主要免疫物質的免疫作用，所以我們進行了禽波氏桿菌OMP的提取工藝及其免疫原性的研究，這為進一步開發(fā)禽波氏桿菌OMP亞單位疫苗奠定了基礎?，F將研究情況報告如下： 試驗一：間接ELlSA檢測禽波氏桿菌抗體方法的建立及臨床應用首次建立

3、了用禽波氏桿菌外膜蛋白作為包被抗原，檢測禽波氏桿菌抗體的間接EL工SA方法。試驗的最佳反應條件為：抗原的稀釋度為1：160(此時蛋白濃度為15μg/mL)；血清稀釋度為1：200；酶標二抗稀釋度為1：4000；用磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L，pH7.4)作包被液；選擇含1％BS5的PBST作封閉液和稀釋液；4℃、24h包被；37℃、3h封閉；血清反應時間為60min；酶標抗體反應時間為45min；底物反應時間為20min。應用該方法

4、檢測禽波氏桿菌陽性血清，其靈敏度為平板凝集試驗的200-400倍；應用該方法臨床上進行血清學調查，其靈敏度為平板凝集試驗的3-4倍，而且還具有良好的穩(wěn)定性和可重復性，較高的特異性和敏感性，操作簡便，快速等特點。 試驗二：禽波氏桿菌外膜蛋白提取及免疫原性的檢測為研究禽波氏桿菌OMP的免疫原性，本試驗采用超聲波破碎、十二烷酰肌氨酸處理技術提取了禽波氏桿菌OMP，采用Bradford方法測定禽波氏桿菌OMP含量，進行了SDS-PAGE

5、電泳檢測，然后制備油乳劑OMP免疫抗原，對1日齡雛雞分別以0.3mL(OMP90μg)、0.5mL(OMP150kg)、0.8mL(OMP240kg)的劑量頸部皮下接種。結果：禽波氏桿菌OMP含量為300P-g/mL；禽波氏桿菌OMP最佳免疫劑量為0.5mL/只；通過免疫抗體與攻毒保護相關性測試，抗體效價在1：2<'8>以上能抵抗致死量禽波氏桿菌的攻擊。據間接ELISA法檢測的抗體水平可知，抗體的持續(xù)時間足以保護雛雞避過易感日齡，試驗發(fā)