兔波氏桿菌免疫原性外膜蛋白和毒力因子的研究.pdf

1、兔支氣管敗血波氏桿菌病是由支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella Bronchiseptica，Bb)引起的一種家兔呼吸道傳染病，該病病程長，反復(fù)發(fā)生，治愈困難，給養(yǎng)兔業(yè)帶來了嚴重的的經(jīng)濟損失。目前預(yù)防該病的全菌疫苗保護力不高，急需研究新的疫苗候選成分，為該病的診斷和預(yù)防提供依據(jù)。外膜蛋白（Outer-membrane proteins，OMPs）在抗藥性、致病性、免疫原性等方面具有重要作用。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選Bb的免疫原性

2、蛋白和可能的毒力因子，以期尋找新的免疫原性蛋白和毒力相關(guān)蛋白。
　　 1.Bb雙向電泳圖譜的建立
　　 為了建立Bb OMPs的2-DE圖譜，本研究利用碳酸鈉法提取OMPs后，采用雙向電泳技術(shù)（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）對其進行分離，并分別對pH值、上樣量、聚焦條件、染色方法等進行優(yōu)化。結(jié)果表明，用裂解液5 M Urea，2MThiourea，2％ CHAPS，2％

3、 SB3～10溶解蛋白，pH4～7的13 cm線性膠條考染上樣量為750μg、銀染上樣量為75μg，聚焦條件為500 V，2h，1000 V，1h，8000 V，2.5h，8000 V，4h時，能獲得聚焦良好、分離清晰的Bb OMPs圖譜。本研究首次建立了Bb OMPs的2-DE圖譜，為其蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.Bb免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 利用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)方法，以兔抗Bb免疫混合血清作為一抗，與通過雙向

4、電泳凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上的Bb OMPs外膜蛋白進行免疫印跡，從中挖取35個具有免疫原性的蛋白，經(jīng)MALDI-TOF-TOF-MS鑒定，成功鑒定了34個蛋白，對應(yīng)23種蛋白質(zhì)。其中，Bb的延長因子Tu已證實有免疫原性，其他22種蛋白均是首次在Bb中證實有免疫原性，對這些蛋白質(zhì)進行亞細胞定位，功能預(yù)測等分析，其中有7種為膜蛋白，4種定位在外膜上，3種定位在內(nèi)膜上，3種周質(zhì)蛋白，3種胞外蛋白，8種胞質(zhì)蛋白，2種未知定位，功能涉及:細胞運動

5、及分泌，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和分子伴侶，能量代謝和轉(zhuǎn)移，氨基酸轉(zhuǎn)運和合成，細胞壁合成，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和合成及功能未知蛋白。這些蛋白有希望成為Bb疫苗的候選成分。
　　 3.Bb差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法，從兩株毒力不同的Bb菌株OMPs中篩選致病性差異相關(guān)蛋白，以期發(fā)現(xiàn)Bb新的毒力因子。RB和HB分別分離自健康兔和鼻炎癥狀的病兔。HB對小鼠半數(shù)致死量為2.42×106 cfu/ml，RB對小鼠表