鴨疫里默氏桿菌hemophore的發(fā)現(xiàn)及作為抗菌靶點(diǎn)的探索.pdf

1、細(xì)菌鐵和血紅素(heme)的利用是當(dāng)前抗菌研究的熱點(diǎn)。本研究針對鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種胞外的heme綁定蛋白hemophore。隨后，通過生物信息學(xué)分析查找到了一個潛在編碼hemophore蛋白的基因家族，我們選取其中一條基因并對其進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)、純化及功能鑒定。最后，為達(dá)到抗菌目的，我們根據(jù)hemophore具有靶向轉(zhuǎn)運(yùn)heme的特點(diǎn)，找到了一種類

2、似heme的藥物SDNS(C32H22N6Na2O6S2)，并初步探索了其在抗RA中的作用。本文主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、鴨疫里默氏桿菌胞外heme綁定蛋白hemophore的發(fā)現(xiàn)及鑒定
　　由于細(xì)菌血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白的表達(dá)受環(huán)境中鐵離子或血紅素濃度的調(diào)節(jié)，我們試圖通過在鐵離子限制性液體培養(yǎng)基或含血紅素的液體培養(yǎng)基中提取RA的分泌蛋白，并鑒定其中是否含有heme綁定蛋白。結(jié)果我們在含血紅素的LB液體培養(yǎng)基中通過TCA沉

3、淀法提取到了一種小分子的heme綁定蛋白，而在鐵離子限制性的TSB培養(yǎng)基中并沒有提取到。說明此蛋白的表達(dá)是受環(huán)境中血紅素的調(diào)控而不受鐵離子的調(diào)控。隨后，我們進(jìn)一步利用血紅素瓊脂糖去捕獲分泌物中的heme綁定蛋白。結(jié)果同樣驗(yàn)證了該蛋白的存在。通過以上試驗(yàn)，表明鴨疫里默氏桿菌可編碼并分泌胞外heme綁定蛋白，我們命名為鴨疫里默氏桿菌hemophore。
　　2、鴨疫里默氏桿菌編碼潛在的hemophore
　　由于鴨疫里默氏桿菌可

4、分泌hemophore蛋白，我們試圖通過生物信息學(xué)分析的方法去發(fā)現(xiàn)編碼hemophore蛋白的基因。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在鴨疫里默氏桿菌RA-GD株基因組注釋中有一條被注釋為“extracellular heme-binding protein”的基因，可能為潛在的hemophore基因。通過序列比對，我們發(fā)現(xiàn)該基因及其同源基因在已測序的4株鴨疫里默氏桿菌中均有編碼且存在一個基因家族。該基因家族包括3個基因，我們分別命名為hemophore1

5、、hemophore2、hemophore3，它們之間序列相似性在70％以上。除RA-CH-1只編碼hemophore1、hemophore2且為雙拷貝外，其余3株鴨疫里默氏桿菌均編碼hemophore1、hemophore2、hemophore3且為單拷貝。信號肽預(yù)測顯示該家族蛋白均含有信號肽，亞細(xì)胞定位預(yù)測表明該家族蛋白主要定位于細(xì)胞外。為對潛在hemophore的功能予以驗(yàn)證，我們對RA ATCC hemophore1進(jìn)行了克隆、

6、原核表達(dá)和蛋白純化。功能鑒定結(jié)果顯示，hemophore1具有綁定血紅素的功能。
　　3、鴨疫里默氏桿菌hemophore可作為潛在的抗菌藥物靶點(diǎn)
　　鴨疫里默氏桿菌體外分離培養(yǎng)需要在血平板上才能生長，而在體內(nèi)，血液是其感染的重要組織。因此我們推測，血液中的血紅素對其生長起著至關(guān)重要的作用。通過基因組分析，我們也證明的這一點(diǎn)(Wang X.et al，2014)。如果我們可以阻斷鴨疫里默氏桿菌對血紅素的需求，我們就可以抑制該