禽波氏桿菌ompA表達(dá)、松花粉多糖亞單位疫苗制備及其免疫原性分析.pdf

1、禽波氏桿菌是一種家禽新型細(xì)菌性疫病的病原菌，它和支氣管敗血波氏桿菌、百日咳波氏桿菌、副百日咳波氏桿菌同屬于產(chǎn)堿桿菌科，波氏桿菌屬?？稍斐呻u胚死亡、孵化率降低、死胚率增加，雛雞的呼吸道癥狀及急性死亡。由于該菌既能夠水平傳播，又能夠垂直傳播，導(dǎo)致了該病代代相傳，逐代擴(kuò)大，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)該病防控所采用的全菌體滅活疫苗存在著某些副作用，如局部非細(xì)菌性炎癥、肉芽腫及降低生產(chǎn)性能等，亟待研發(fā)新型疫苗。OmpA是禽波氏桿菌最主要的

2、免疫保護(hù)性抗原之一，具有被開發(fā)利用為亞單位疫苗的潛力。因此，本課題計(jì)劃對(duì)禽波氏桿菌ompA基因進(jìn)行原核表達(dá)和畢赤酵母真核表達(dá)，利用表達(dá)產(chǎn)物與泰山松花粉多糖佐劑構(gòu)建成基因工程亞單位疫苗，以期為禽波氏桿菌的免疫防控提供新的技術(shù)支撐和理論依據(jù)。
　　1.禽波氏桿菌ompA基因的原核表達(dá)
　　設(shè)計(jì)引物，對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離得到的禽波氏桿菌P5株的ompA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收后連接到pMD-18T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI發(fā)表

3、的ompA基因（App1-597，NCBI GeneBank序列號(hào):M96550.1）同源性為100％。將ompA基因連接到pET32a+表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入E.coli BL21進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，37℃，8h，產(chǎn)物蛋白以包涵體的形式進(jìn)行高效表達(dá)。表達(dá)的ompA通過(guò)HIS標(biāo)簽鎳柱層析法進(jìn)行純化，純化蛋白的SDS-PAGE顯示目的條帶大小與預(yù)期相符，為47KD左右。Western blotting分析采用抗HIS標(biāo)簽的單克隆抗體作為一抗，采

4、用DAB顯色法進(jìn)顯色，可見約47KD大小的特異性條帶，與SDS-PAGE分析相符。本研究為禽波氏桿菌亞單位疫苗的制備提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　2.泰山松花粉多糖對(duì)禽波氏桿菌ompA原核表達(dá)產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)的影響
　　為研究泰山松花粉多糖(TPPPS)對(duì)禽波氏桿菌外膜蛋白A(ompA)基因工程亞單位疫苗在小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)的影響，將提取的泰山松花粉多糖與原核表達(dá)的ompA一定體積配比制成疫苗。雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分為6組，

5、Ⅰ-Ⅴ組分別注射3個(gè)不同多糖劑量(200mg/kg、400 mg/kg、800 mg/kg)的ompA疫苗，弗氏佐劑-ompA和純化ompA。在免疫后分七次檢測(cè)抗體效價(jià)、白介素-2含量、CD4+和CD8+水平、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和小腸SIgA含量。結(jié)果顯示，僅注射ompA不能刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠的抗體保護(hù)，泰山松花粉多糖和弗氏佐劑都能夠提高小鼠針對(duì)ompA的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。400mg/kg的松花粉多糖效果顯著(p＜0.05)，優(yōu)于其他

6、兩個(gè)劑量的松花粉多糖和弗氏佐劑，且未造成任何的局部炎癥反應(yīng)和組織損害。松花粉多糖的研究為基因工程亞單位疫苗佐劑的研制和解決原核表達(dá)蛋白的低免疫原性提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。
　　3.禽波氏桿菌ompA畢赤酵母表達(dá)
　　設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增禽波氏桿菌P5株的ompA基因，膠回收后克隆到pMD-18T載體進(jìn)行測(cè)序。將ompA基因連接到表達(dá)質(zhì)粒pPIC9質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化入DH5a擴(kuò)增后，Licl化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，篩選陽(yáng)