長(zhǎng)效核黃素的分離純化工藝及定向合成研究.pdf

1、核黃素是黃素輔基的組成成分，參與機(jī)體復(fù)雜的氧化過程，具有重要的藥理學(xué)作用，除治療傳統(tǒng)的核黃素缺乏病外，新近的藥理學(xué)研究表明核黃素及其衍生物還具有輔助治療冠心病、高血壓、關(guān)節(jié)炎、燒傷等方面的作用。但核黃素是水溶性維生素，易從汗液及尿中排除體外，半衰期短，生物利用度低，難以發(fā)揮藥物治療效果，極易引起各種核黃紊缺乏癥。我院于本世紀(jì)60年代研制了長(zhǎng)效核黃素油混懸注射液制劑，一次肌肉注射150mg，長(zhǎng)效三個(gè)月，并曾于70年代和90年代先后兩次裝備

2、部隊(duì)，為防治常見的核黃素缺乏病提供了一種重要的藥物療法。近些年來的應(yīng)用還發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)效核黃素制劑在白血病骨髓移植和抗腫瘤化療、放療的輔助治療中獲得了滿意的效果，增強(qiáng)了病人的耐受性，提高了治療效果，顯示了廣闊的應(yīng)用前景。但該藥由于沒有臨床批文，目前只在部隊(duì)醫(yī)院內(nèi)部使用，限制了進(jìn)一步的推廣。以往的研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)效核黃素為一多組分混合物，其主要有效成分9010-Ⅰ屬我們首次合成的一種核黃素衍生物，其溶解度低，不能在水溶液中穩(wěn)定存在，分離純化十分困難，過

3、去沿用的TLC及HPLC方法只能純化極少量的樣品，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化放大，純化獲取大量長(zhǎng)效核黃素單組分(9010-Ⅰ)就成為制約新藥開發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。 本研究目的在于重點(diǎn)解決長(zhǎng)效核黃素單組分(9010-Ⅰ)分離純化的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸問題，建立能大量制備長(zhǎng)效核黃素單組分的純化工藝，按一類新藥要求制備1kg以上樣品，為完成新藥臨床前研究提供原料藥，同時(shí)利用酶促催化的高選擇性，探索長(zhǎng)效核黃素9010-Ⅰ的定向合成，為尋找一種高選擇的合成途徑

4、打下基礎(chǔ)，主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下： 1.通過對(duì)不同載體及洗脫溶劑的選擇，最終建立了以LH-20為載體，DMF為洗脫溶劑的柱層析方法，一次柱層析樣品純度達(dá)標(biāo)90.59％，所得樣品用乙酸乙酯兩次重結(jié)晶，樣品純度經(jīng)HPLC分析可達(dá)99.85％，最終收率按原料計(jì)算為23.70％。該制備工藝具有重現(xiàn)性好，凝膠柱對(duì)樣品基本無吸附，回收率高，洗脫溶劑可回收反復(fù)利用等特點(diǎn)，該工藝還可以根據(jù)生產(chǎn)要求進(jìn)行平行放大，可滿足大規(guī)模制備的要求。目前，已用

5、此工藝制備了1Kg以上的純品，該化合物經(jīng)四大光譜及二維超導(dǎo)核磁共振分析鑒定其結(jié)構(gòu)式為核黃素-5'-月桂酸酯。 2.從一株芽孢桿菌中克隆209蛋白酶的基因，該酶的基因與枯草芽孢桿菌蛋白酶BPN'基因密碼有89.01％相似性，而翻譯的氨基酸有97.38％的相似。在該酶的42個(gè)與枯草桿菌蛋白酶BPN'基因不同的密碼中，有32個(gè)密碼為同義密碼。在克隆209蛋白酶基因的基礎(chǔ)上，本文通過構(gòu)建不同缺失片段的重組子，篩選到了一株缺失信號(hào)肽序列的

6、基因片段，以pET3a為載體在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，表達(dá)量為47.27％，所得的酶具有很高的催化活性，比活性為28U/mg。該酶在pH=10顯示最高的催化活性，穩(wěn)定性高，最適催化溫度為60℃。以DEAE纖維素為載體固定化表達(dá)的酶，用月桂酸乙酯為?；瘎珼MF作為助溶劑，對(duì)核黃素實(shí)現(xiàn)了定向?；?，薄層層析、HPLC及FAB質(zhì)譜分析均證明反應(yīng)產(chǎn)物為目標(biāo)化合物9010-Ⅰ。 總之，本文成功地建立了大量純化9010-