皂莢提取物對肝癌細(xì)胞小鼠TGF-β-Smads信號系統(tǒng)調(diào)控的影響.pdf

1、目的：通過研究皂莢提取物(乙酸乙酯提取)對小鼠肝癌細(xì)胞TGF-β/Smads信號系統(tǒng)調(diào)控的影響，為皂莢提取物(乙酸乙酯提取)是否具有抗肝癌的作用提供參考。
　　 方法：
　　 第一部分：理論探討
　　 1從中醫(yī)理論上闡明痰和腫瘤的關(guān)系。強調(diào)痰、毒和瘀相互影響、相互轉(zhuǎn)化、相互膠著是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。
　　 2提出從“痰”論治肝癌的可行性。并闡明化痰藥口皂莢”具有抗癌作用的前期研究依據(jù)。
　　 第

2、二部分：皂莢的文獻(xiàn)研究
　　 從皂莢的一般特性研究；皂莢的歷史研究探討；含有皂莢的方劑研究；皂莢的藥理學(xué)研究和皂莢的臨床應(yīng)用等方面闡明皂莢的特點和研究價值。
　　 第三部分：實驗研究
　　 我們采用清潔級的昆明種小鼠60只。通過隨機方法(隨機數(shù)字表法)將實驗動物分為6組，實驗分為陰性對照組(吐溫80溶劑)；皂莢提取物(乙酸乙酯提取)3個濃度組(26.0mg/d、13.0mg/d、7.8mg/d)；陽性對照組(金龍

3、膠囊組)；空白對照組(不造模組)。每組10只小鼠。造模采用小鼠右腋皮下接種H22肝癌細(xì)胞懸液的方法。造模后第2天到第16天，按實驗分組和要求(每只灌胃量為0.4m1，已經(jīng)配好濃度)進(jìn)行灌胃。造模后第17天處死小鼠，收集標(biāo)本進(jìn)行各項檢查。實驗一：觀察各組小鼠大體情況；各組小鼠死亡率；各組小鼠剝瘤稱重，計算各組腫瘤抑制率和病理學(xué)觀察。實驗二：檢測各組小鼠血清中的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)，堿性磷酸酶(ALP)，總蛋白(TP)，白蛋白(ALB

4、)和甲胎蛋白(AFP)的濃度。實驗三：實時熒光定量的方法檢測各組小鼠肝臟組織中的Smad4mRNA和Smad7mRNA的表達(dá)。實驗四：免疫組化的方法檢測Smad4和Smad7蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 實驗一：皂莢提取物對接種H22肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠一般生物學(xué)特性和病理學(xué)的觀察
　　 1鼠大體觀察：空白對照組小鼠活動正常，精神狀態(tài)很好，毛發(fā)正常，并且有光澤，飲食正常，大小便正常。皂莢提取物(高劑量組)，皂莢

5、提取物(中劑量組)，皂莢提取物(低劑量組)和陽性對照組(金龍膠囊組)，各組小鼠毛發(fā)脫落、有稀疏感、光澤度欠佳，精神不振，活動明顯減少，飲食較空白對照組明顯減少，飲水少較空白對照組明顯減少不明顯，大小便情況較空白對照組少，對外界反應(yīng)慢。陰性對照組(溶劑土溫80)的情況類似。右側(cè)前肢接種H22肝癌細(xì)胞的小鼠，接種部位可見大小不等的腫塊。有部分小鼠腹腔部位出現(xiàn)腹部脹大，用指尖觸診，有明顯波動感，考慮為形成的腹水。
　　 2昆明種小鼠的

6、死亡率達(dá)21.67％。
　　 3各組小鼠腫瘤重量比較：皂莢提取物(高)平均腫瘤重量2.87±0.34，皂莢提取物(中)平均腫瘤重量3.68±0.34，皂莢提取物(低)平均腫瘤重量3.64±0.36，陽性對照組平均腫瘤重量2.60±0.36與陰性對照組平均腫瘤重量4.73±0.40比較明顯降低，P＜0.01；陰性對照組，皂莢提取物(中)，皂莢提取物(低)與陽性對照組比較明顯增高，P＜0.01；皂莢提取物(高)與陽性對照組比較腫瘤重

7、量無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。
　　 各組小鼠腫瘤抑制率：陽性對照組為45％；陰性對照組為0；皂莢提取物高劑量組39％；皂莢提取物中劑量組22％；皂莢提取物低劑量組為23％。
　　 4病理學(xué)觀察：空白對照組小鼠肝臟的肉眼和顯微鏡下觀察都表現(xiàn)正常，模型組各組小鼠總體上較空白對照組(非模型組)有更多的不正常的表現(xiàn)。
　　 陰性對照組，皂莢提取物中劑量組和皂莢提取物低劑量組病理學(xué)觀察：肉眼大體觀察：小鼠的肝臟體積較空白

8、對照組小鼠明顯增大；質(zhì)地較空白對照組硬度增強；肝臟表面可見多個散在的灰白結(jié)節(jié)。陰性對照組最多，皂莢提取物中劑量組和皂莢提取物低劑量組比陰性對照組略少。光學(xué)顯微鏡下：肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞索排列不整齊。細(xì)胞核形態(tài)明顯異常，肝細(xì)胞有部分細(xì)胞核增大，或核質(zhì)比例增大。
　　 陽性對照組，皂莢提取物高劑量組病理學(xué)觀察：肉眼大體觀察：小鼠的肝臟體積較空白對照組小鼠略有增大；質(zhì)地較空白對照組硬度略有增強，但不及陰性對照組；肝臟表面可以偶見散

9、在的灰白結(jié)節(jié)。陽性對照組和皂莢提取物高劑量組沒有明顯差別。光學(xué)顯微鏡下：肝小葉結(jié)構(gòu)欠清晰，肝細(xì)胞索排列不整齊。細(xì)胞核形態(tài)異常不明顯。推測皂莢提取物高劑量組能通過對肝癌癌瘤有明顯抑制癌細(xì)胞生長的作用，從而延緩肝癌細(xì)胞造成肝臟組織的進(jìn)一步損傷，從而起到保護(hù)肝臟的目的。
　　 實驗二：皂莢提取物對接種H22肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠肝功能相關(guān)指標(biāo)的影響
　　 小鼠血清GGT水平：陽性對照組平均值23±2U/L、皂莢提取物組(高)平均值2

10、3±2 U/L與陰性對照組平均值38±2U/L比較明顯降低，P＜0.01；皂莢提取物組(中)平均值27±2U/L，皂莢提取物組(低)平均值37±2U/L與陰性對照組平均值比較降低P＜0.05。皂莢提取物組(中)平均值，皂莢提取物組(低)平均值，陰性對照組平均值與陽性對照組平均值比較明顯降低，P＜0.01。
　　 小鼠血清ALP水平：陽性對照組平均值25±5 IU/L、皂莢提取物組(高)平均值34±6 IU/L、皂莢提取物組(中)

11、平均值56土5 IU/L與陰性對照組平均值90±8 IU/L比較明顯降低，P＜0.01；皂莢提取物組(低)平均值75±7水平于陰性對照組比較降低P＜0.05。皂莢提取物組(高)、皂莢提取物組(中)，皂莢提取物組(低)，陰性對照組ALP水平于陽性對照組比較明顯降低，P＜0.01。
　　 小鼠血清TP：陽性對照組平均值70±2、皂莢提取物組(高)平均值65±6、皂莢提取物組(中)平均值59±3和皂莢提取物組(低)平均值58±3的TP

12、水平于陰性對照組平均值47±4比較明顯增高，P＜0.01；。皂莢提取物組(中)，皂莢提取物組(低)和陰性對照組的TP水平于陽性對照組比較明顯降低，P＜0.01。
　　 小鼠血清ALB：陽性對照組平均值30±2、皂莢提取物組(高)平均值29±1的小鼠ALB水平于陰性對照組平均值22±2比較明顯增高，P＜0.01。皂莢提取物組(中)平均值25±3，皂莢提取物組(低)平均值23±2和陰性對照組的小鼠ALB水平于陽性對照組比較明顯降低，

13、P＜0.01。
　　 小鼠血清AFP：結(jié)果各組小鼠AFP的數(shù)值均沒有測出。實驗三：皂莢提取物對接種H22肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路smad4 mRNA和smd7 mRNA表達(dá)的影響
　　 Smad4mRNA表達(dá)：擴增倍數(shù)陽性對照組平均值0.566±0.092和皂莢提取物高劑量組平均值0.471±0.069與陰性對照組平均值0.320±0.099比較明顯增高，P＜0.01；皂莢提取物中劑量組平均值0

14、.363±0.058和皂莢提取物低劑量組平均值0.280±0.067與陽性對照組比較比較明顯降低，P＜0.01。
　　 Smad7mRNA表達(dá)：擴增倍數(shù)陽性對照組平均值2.007±0.499、皂莢提取物組(高劑量組)平均值2.230±0.491的小鼠肝臟組織中Smad7mRNA表達(dá)水平于陰性對照組平均值3.537±0.401比較明顯降低，P＜0.01。
　　 皂莢提取物組(中劑量組)平均值3.106±0.410，皂莢提取

15、物組(低劑量組)平均值3.613±0.416和陰性對照組小鼠肝組織中Smad7mRNA表達(dá)水平于陽性對照組比較明顯增高，P＜0.01。
　　 實驗四：皂莢提取物對接種H22肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠TGF-β/Smds信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路smd4和smd7蛋白表達(dá)的影響
　　 Smd4蛋白表達(dá)：陽性對照組的小鼠肝臟Smad4蛋白表達(dá)水平平均值2973.190±248.540與陰性對照組平均值1196.399±837比較明顯增高，P＜0.0

16、1。皂莢提取物組(高劑量組)平均值2295.187±820.119與陰性對照組比較增高，P＜0.05。
　　 陰性對照組的小鼠肝臟Smad4蛋白表達(dá)水平與陽性對照組比較明顯降低，P＜0.01。皂莢提取物組(中劑量組)平均值1558.835土302.801和皂莢提取物組(低劑量組)平均值988.614±338.995與陽性對照組比較降低，P＜0.05。
　　 Smad7蛋白表達(dá)：陽性對照組平均值1454.381±302.4

17、05和皂莢提取物組(高劑量組)平均值1494.202±399.553的小鼠肝臟Smad7蛋白表達(dá)水平與陰性對照組平均值2239.589±272.892比較明顯降低，P＜0.01。皂莢提取物組(中劑量組)平均值1496.981±505.121與陰性對照組比較降低，P＜0.05。
　　 陰性對照組和皂莢提取物組(低劑量組)平均值2330.056±177.105的小鼠肝臟Smad7蛋白表達(dá)水平與陽性對照組比較明顯增高，P＜0.01。<

18、br>　　 結(jié)論：皂莢提取物(乙酸乙酯提取)的抗肝癌的作用可能有下列機理實現(xiàn)：①改善荷瘤小鼠的生存質(zhì)量而抑制腫瘤對機體的損傷。②通過抑制接種部位腫瘤體的大小而起到抗癌的作用。③通過保護(hù)荷瘤小鼠的肝臟功能而起到保護(hù)肝臟的作用④皂莢提取物高劑量組(26.0mg/d)能通過增強Smad4mRNA的表達(dá)和下調(diào)Smad7mRNA的表達(dá)。⑤皂莢提取物高劑量組(26.0mg/d)能通過增強Smad4蛋白的表達(dá)和下調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)。綜合起到抗癌