基于化痰法探討皂莢提取物對肝癌大鼠microRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：本課題前期研究發(fā)現(xiàn)中藥化痰藥皂莢具有明顯抗肝癌的作用，皂莢提取物能夠明顯調(diào)控肝癌細(xì)胞 TGF-β/Smads信號系統(tǒng)以及PTEN/PI3K/AKT信號通路。我們推測皂莢提取物可能通過調(diào)節(jié)其相關(guān)microRNAs表達(dá)來調(diào)控相關(guān)信號分子，從而發(fā)揮抗肝癌的作用。在前期研究的基礎(chǔ)上，我們通過理論和實(shí)驗(yàn)研究，選擇與之相關(guān)的microRNAs及靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)一步闡明該藥治療肝癌的分子機(jī)制，為中藥皂莢開發(fā)及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　

2、方法：
　　第一部分理論研究
　　1.中醫(yī)藥防治肝癌的歷史悠久，在肝癌的病情進(jìn)展中痰瘀互結(jié)貫穿于疾病始終，化痰法是治療肝癌的重要治法，也應(yīng)貫徹肝癌治療的始終。
　　2.說明中藥化痰藥皂莢的價(jià)值、特點(diǎn)及古今臨床應(yīng)用。并闡述皂莢提取物具有抗肝癌作用的前期研究依據(jù)。
　　3.隨著分子生物學(xué)對肝癌的研究進(jìn)展，肝癌分子靶向治療是當(dāng)今臨床研究最為活躍的領(lǐng)域之一，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，闡明中醫(yī)藥防治肝癌的

3、機(jī)制，是中醫(yī)藥對肝癌防治的發(fā)展方向，也有助于發(fā)現(xiàn)肝癌治療的新靶點(diǎn)。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)研究
　　1. Walker-256移植性肝癌大鼠模型的建立
　　取出儲存 Walker-256癌細(xì)胞株的凍存管，立即放進(jìn)37℃水浴槽中，等待完全融化過后，再將其取出，并于無菌的環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞懸液吹打，然后轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液到15ml離心管中。稍微晃動離心管，逐漸加入 PBS緩沖液到8ml為止。然后以每分鐘1000轉(zhuǎn)的速度離心離心管10min

4、，去除上清液，用PBS緩沖液沖洗2次。然后以4ml PBS緩沖液進(jìn)行細(xì)胞重懸，將細(xì)胞懸液收入5ml注射器，再將其注入5只Wistar大鼠腹腔，每只注入1ml。每天觀察大鼠腹部膨隆情況，20天后形成癌性腹水。
　　將上述 Wistar大鼠腹腔內(nèi)的紅色洗肉水樣癌性腹水用注射器抽出15ml，放入離心機(jī)內(nèi)以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度離心2min,離心后去除上層清液體,保留下層粘稠的濃縮液體，用PBS緩沖液沖洗3次,制備細(xì)胞懸液備用，密度為2

5、x107/ml。
　　將65只約200g左右的SD大鼠按體重平均分為6組，即空白組、模型組、皂莢提取物高劑量組，皂莢提取物中劑量組，皂莢提取物低劑量組及索拉非尼組，每組10只。另外5只作為驗(yàn)證造模而備用。實(shí)驗(yàn)手術(shù)前大鼠禁食12小時(shí)，將模型組、皂莢提取物高劑量組，皂莢提取物中劑量組，皂莢提取物低劑量組及索拉非尼組分別按40μg/100g體重水合氯醛腹腔內(nèi)麻醉，將大鼠以仰臥位固定在鼠板上，然后以0.5％活力碘腹部消毒，用手術(shù)剪沿腹白線

6、剪開腹部皮膚，接著逐層分離，使大鼠腹腔暴露，即可以看到肝臟膨出。選擇最外層的肝葉，用注射器抽取1ml癌性腹水細(xì)胞懸液，以45度將注射器斜刺入所選肝葉內(nèi)，深度約0.5cm，0.15ml細(xì)胞懸液緩緩?fù)扑妥⑸淦髯⑷胫苽涞陌┬愿顾?，立即拔出注射器針頭，用消毒棉簽按壓穿刺點(diǎn)一直到不出血為止，將肝臟還納入腹腔內(nèi)，常規(guī)縫合關(guān)閉腹腔，紅霉素軟膏擦拭消毒傷口。
　　為證實(shí)造模成功，所有53只大鼠造模完畢后，在造模后第7天，在其中隨機(jī)挑選3只，另外1

7、2只正常大鼠中挑選2只，取出大鼠肝臟，觀察病理切片。
　　2.處理措施
　　根據(jù)人臨床用量（皂莢生藥量1.5g.70kg.d-1），給藥劑量根據(jù)參考文獻(xiàn)，人與大鼠體表面積折算的等效劑量計(jì)算為實(shí)驗(yàn)灌胃劑量（折算系數(shù)如下表，人體平均體重標(biāo)準(zhǔn)為70kg，大鼠平均體重標(biāo)準(zhǔn)為200g），按1：2：4設(shè)置皂莢提取物低劑量組(128.57mg.kg.d-1)、中劑量組(257.14mg.kg.d-1)和高劑量組(514.28mg.kg.d

8、-1);索拉非尼:68.57mg/kg/d（索拉非尼成人0.8g/d,按人與小鼠體表面積折算的等效劑量計(jì)算）；空白組給予0.9%生理鹽水10 ml/kg/d；模型組：建立肝癌模型后，給藥同空白組；各組灌胃給藥量均為相同體積；移植后1周后開始治療；各組連用28d。終止治療時(shí)間為移植后35d。
　　將需取材大鼠行頸推脫臼處死,在無菌條件下，消毒后進(jìn)行開腹，空白組選取大鼠組織結(jié)構(gòu)完整的部分做肝臟標(biāo)本；經(jīng)過造模的大鼠，選取肝臟內(nèi)癌組織，如

9、有肝癌結(jié)節(jié)者，盡量取最大的部分；將取出組織用濾紙吸干后留存，將待檢測組織分組處理，切成范圍為1cm×1cm，厚0.2cm的組織塊，連續(xù)切片，用甲醛乙醇混合液對其進(jìn)行固定3小時(shí),然后自動脫水固定，用于 HE染色及Tunel細(xì)胞凋亡檢測大鼠肝臟病理切片的制作。
　　3.實(shí)驗(yàn)方法
　　實(shí)驗(yàn)一：觀察各組大鼠組織病理切片的形態(tài)學(xué)改變；用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)觀察各組組織中細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　實(shí)

10、驗(yàn)二：用Real-time PCR檢測技術(shù)檢測各組大鼠組織中miR-21、miR-181b、miR-183的表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　實(shí)驗(yàn)三：用Western-blot檢測法和Real-time PCR檢測法，檢測各組大鼠組織中，PTEN、TIMP3、MMP2、MMP9、PDCD4蛋白和mRNA的表達(dá)量，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對比分析。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一皂莢提取物對肝癌大鼠病理組織形態(tài)的影響
　　1.從形態(tài)學(xué)

11、角度觀察
　　正常組中肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞胞漿胞核均勻，肝細(xì)胞索排列整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列。胞核較大，位于肝細(xì)胞中央，整個(gè)狀態(tài)均一。肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤,無纖維組織增生。
　　而模型組中肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，大部分肝小葉被腫瘤組織代替，周邊的肝小葉受壓質(zhì)地變實(shí)，肝竇擴(kuò)張，肝血竇周圍可見纖維組織增生。匯管區(qū)明顯增寬,有大量的成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞呈圓形，再生活躍，異型性明顯，細(xì)胞核染色變深，

12、核質(zhì)比變大，部分出現(xiàn)核固縮和核碎裂現(xiàn)象，腫瘤細(xì)胞呈團(tuán)塊狀分布，有的部分出現(xiàn)凝固性壞死，染色呈深紅色。
　　將皂莢提取物低劑量組的病理切片和模型組相比，雖然可見肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，一部分肝小葉被腫瘤組織取代；但細(xì)胞形態(tài)有些許的改善，不過依然出現(xiàn)很嚴(yán)重的核固縮現(xiàn)象，核質(zhì)比很大，部分細(xì)胞呈團(tuán)塊狀。肝竇擴(kuò)張，肝血竇周圍有纖維組織增生。
　　皂莢提取物中劑量組相對于模型組來看，有較大程度的改善，可明顯看出肝小葉的結(jié)構(gòu)有了一定的恢復(fù)，腫

13、瘤組織、異型性細(xì)胞數(shù)量和過塑細(xì)胞數(shù)量減少，核質(zhì)比較大的細(xì)胞數(shù)量也明顯減少。肝血竇周圍偶爾可見到纖維組織增生。
　　皂莢提取物高劑量組中，從形態(tài)上看肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰完整，細(xì)胞胞漿胞核均勻，大部分肝小葉細(xì)胞正常，部分細(xì)胞有核固縮和異型性的現(xiàn)象，但是相較于模型組，狀態(tài)改善很明顯。肝血竇周圍很少見到纖維組織增生。
　　索拉菲尼組的形態(tài)學(xué)較模型組改變最為明顯，并且最接近于正常組，肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰完整，細(xì)胞胞漿胞核均勻，肝細(xì)胞索排列

14、整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列。胞核較大，位于肝細(xì)胞中央，整體分布較均一。肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤,基本沒有纖維組織增生。與正常組相比，有很少部分細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)異型性，無團(tuán)狀分布現(xiàn)象。
　　2.采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)，觀察6組切片的細(xì)胞凋亡情況，每組取4個(gè)視野，顯微鏡下組織切片上凋亡的細(xì)胞為棕褐色，圖像分析系統(tǒng)定量分析肝癌細(xì)胞的凋亡指數(shù)。通過 ANOVA檢測，P=0.000，P＜0.01，n=24，六組間比較

15、有顯著性差異，各組間兩兩比較，皂莢提取物組與索拉非尼組比較，P=0.274,P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余各組間均有顯著性差異（P=0.000,P＜0.01）。
　　實(shí)驗(yàn)二皂莢提取物對肝癌大鼠miRNA的影響
　　1.通過Real-time PCR檢測肝癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平。通過單因素方差分析，6組 miR-21的表達(dá)量有顯著性差異（P=0.000，P＜0.01）。各組間兩兩比較，除皂莢提取物高劑量組和索拉非

16、尼組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.975，P＞0.05）。其余各組間均有顯著性差異（P＜0.01）。
　　2.通過Real-time PCR檢測肝癌細(xì)胞中miR-181b的表達(dá)水平。通過單因素方差分析，6組 miR-181b的表達(dá)量有顯著性差異（P=0.000，P＜0.01）。各組間兩兩比較，除皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.954，P＞0.05）。其余各組間均有顯著性差異（P＜0.01）。
　　

17、3.通過Real-time PCR檢測肝癌細(xì)胞中miR-183的表達(dá)水平（見表4和圖7）。通過單因素方差分析，6組 miR-183的表達(dá)量有顯著性差異（P=0.000，P＜0.01）。各組間兩兩比較，除皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.023，P＜0.05）。其余各組間均有顯著性差異（P＜0.01）。
　　實(shí)驗(yàn)三皂莢提取物對肝癌大鼠 PTEN、TIMP3、MMP2、MMP9、PDCD4 mRNA和蛋白的影響<

18、br>　　1.分別應(yīng)用QRT-PCR和Western blot檢測肝癌大鼠組織中PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)水平，通過單因素方差分析，6組中PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)水平均有顯著性差異（P=0.000，P＜0.01）。各組間 PTENmRNA兩兩比較，皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.365，P＞0.05）。各組間PTEN蛋白兩兩比較，模型組和皂莢提取物低劑量組比較（P=0.011，P＜0.05），皂莢提

19、取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.076，P＞0.05），其余各組間均有顯著性差異(P＜0.01)。
　　2.檢測肝癌大鼠組織中TIMP-3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，通過單因素方差分析，6組中TIMP-3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均有顯著性差異（P=0.000，P＜0.01）。各組間TIMP-3 mRNA兩兩比較，皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.064，P＞0.05）。各組間 TI

20、MP-3蛋白兩兩比較，皂莢提取物中劑量組和皂莢提取物低劑量組比較（P=0.017，P＜0.05），皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.054，P＞0.05），其余各組間均有顯著性差異(P＜0.01)。
　　3.檢測肝癌大鼠組織中MMP2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，通過單因素方差分析，6組中MMP2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均有顯著性差異（P=0.000，P＜0.01）。各組間MMP2 mRNA兩兩比較，模型

21、組和皂莢提取物低劑量組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.015，P＜0.05），皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.996，P＞0.05）。各組間 MMP2蛋白兩兩比較，空白組與索拉非尼組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.04，P＜0.05），模型組和皂莢提取物低劑量組比較（P=0.036，P＜0.05），皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.129，P＞0.05），其余各組間均有顯著性差異(P＜0.01)

22、。
　　4.肝癌大鼠組織中MMP9 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，通過單因素方差分析，6組中MMP9 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均有顯著性差異（P=0.000，P＜0.01）。各組間MMP9 mRNA兩兩比較，模型組和皂莢提取物低劑量組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.032，P＜0.05），皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.859，P＞0.05）。各組間 MMP9蛋白兩兩比較，空白組與索拉非尼組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=

23、0.035，P＜0.05），模型組和皂莢提取物低劑量組比較（P=0.015，P＜0.05）、低劑量組和中劑量組比較（P=0.013，P＜0.05）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，皂莢提取物高劑量組和索拉非尼組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.189，P＞0.05），其余各組間均有顯著性差異(P＜0.01)。
　　5.檢測肝癌大鼠組織中PDCD4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，通過單因素方差分析，6組中PDCD4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均有顯著性差異（

24、P=0.000，P＜0.01）。各組間PDCD4 mRNA兩兩比較，模型組和皂莢提取物低劑量組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.025，P＜0.05），其余各組間兩兩比較均有顯著性差異(P＜0.01)。各組間 PDCD4蛋白兩兩比較均有顯著性差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論：1.皂莢提取物能夠誘導(dǎo) Walker-256移植性大鼠肝癌細(xì)胞凋亡，具有顯著的抗肝癌效應(yīng)，其中以高劑量組效果最明顯，與索拉非尼無明顯差異。
　　2.皂莢提取物在

25、誘導(dǎo)大鼠肝癌細(xì)胞凋亡的過程中，可下調(diào)肝癌細(xì)胞中miR-21，同時(shí)上調(diào)抑癌基因 PTEN基因和蛋白的表達(dá)；還能夠使 miR-181b下調(diào)，同時(shí)影響 TIMP3(基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3)/MMP2（基質(zhì)金屬蛋白酶2）/MMP9（基質(zhì)金屬蛋白酶9）系統(tǒng)；還可以下調(diào) miR-183，同時(shí)上調(diào)其靶目標(biāo)-抑癌基因PDCD4（程序性細(xì)胞凋亡因子4），其中以高劑量組的效果最顯著，與索拉非尼組沒有明顯差異。
　　3.通過皂莢提起物能夠調(diào)控 miR