PtCBF轉(zhuǎn)化枳和椪柑及在枳和椪柑內(nèi)的時(shí)空表達(dá).pdf

1、柑橘經(jīng)常受到凍害、干旱、鹽堿等環(huán)境因素的脅迫,嚴(yán)重阻礙了柑橘業(yè)的健康發(fā)展。因此,研究植物對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答機(jī)制,利用基因工程手段提高植物的抗逆性,已成為柑橘業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵性工作。
　　 CBF(C-repeat binding factor)是調(diào)控一系列植物冷馴化相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,被低溫誘導(dǎo)表達(dá),與相應(yīng)順式作用元件CRT/DRE(C-repeat/dehydrationresponsive element)結(jié)合,誘導(dǎo)冷相關(guān)基因

2、的表達(dá),進(jìn)而合成抗寒相關(guān)的糖類、脯氨酸和膜穩(wěn)定蛋白等物質(zhì),提高植物的抗寒性。因此,利用CBF轉(zhuǎn)化柑橘有望成為培育柑橘抗寒新品種的有效途徑。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前人已經(jīng)構(gòu)建好CBF-GFP融合基因的農(nóng)桿菌表達(dá)載體CG2301。本試驗(yàn)旨將已經(jīng)構(gòu)建好的表達(dá)載體CG2301通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)和椪柑(Citrus reticulata Blanc)。低溫處理轉(zhuǎn)基因植株,在熒光顯微鏡下

3、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因苗的時(shí)空表達(dá)。
　　 主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1)CG2301的亞細(xì)胞定位:通過基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞,熒光顯微鏡下檢測(cè),熒光集中在細(xì)胞核上,表明PtCBF定位于細(xì)胞核。
　　 2)轉(zhuǎn)基因苗的獲得:融合基因表達(dá)載體CG2301通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入枳和椪柑,獲得轉(zhuǎn)基因苗,其中一些轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行了盆栽和擴(kuò)繁。
　　 3)CBF基因的空間表達(dá):4℃處理轉(zhuǎn)基因枳,根部比較敏感,15min后發(fā)出較強(qiáng)熒光

4、,而莖部和葉片背面發(fā)出較弱熒光。隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng),葉片,莖部熒光表達(dá)逐漸增強(qiáng),葉片正面的翼葉和三片復(fù)葉的連接處、葉柄和莖的連接處及幼葉的熒光表達(dá)較強(qiáng)。轉(zhuǎn)基因枳熒光發(fā)光部位并不是機(jī)械的均一,本試驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)整個(gè)植株或整個(gè)葉片全部發(fā)光的現(xiàn)象。熒光表達(dá)多發(fā)生在根、葉片等組織較薄的地方,而莖部表達(dá)相對(duì)較少?？购暂^枳殼弱的椪柑4℃處理后,有少量綠色熒光產(chǎn)生。其中,葉片背面主脈處、莖部熒光表達(dá)較強(qiáng)。
　　 4)CBF基因的時(shí)間表達(dá):枳轉(zhuǎn)