中華蘆薈抗逆基因AlDREB2和AlTINY的克隆與功能的初步分析.pdf

1、中華蘆薈(Aloe vera L．var． chinensis(Haw．)Berger)，百合科蘆薈屬多年生肉質(zhì)草本植物，起源于非洲石漠和沙漠地區(qū)，為景天酸科代謝植物。中華蘆薈為庫拉索蘆薈在我國的一個變種。葉片肥厚多汁，成熟葉片的大部分體積為貯水組織，形成了很強(qiáng)的保水、耐早和耐熱的能力。由于富含有許多生物活性物質(zhì)，蘆薈在醫(yī)藥，化工行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用，其研究也集中于蘆薈生物活性物質(zhì)的提取及研究并在這些方面達(dá)到了較高的水平。 另一方

2、面蘆薈是典型的早生植物，已有的研究也表明蘆薈對高鹽及病蟲害等各種脅迫都具有較強(qiáng)的抵抗能力。植物對逆境的抵抗一直是研究的熱點(diǎn)，但主要集中在各種重要農(nóng)作物和模式植物上。在自然界中存在著許多天然的抗各種逆境的植物，漫長的進(jìn)化過程中使其積累了豐富的抗逆基因。蘆薈是一種能夠抵抗多種逆境的植物，但目前在這方面的研究較少，且大部分集中于從蘆薈生理形態(tài)上進(jìn)行解釋，而從分子水平上對其抗逆性的研究幾乎沒見報道。 為了更進(jìn)一步的研究蘆薈的抗逆性，本實

3、驗從中華蘆薈中克隆得到了兩個抗逆相關(guān)的DREB轉(zhuǎn)錄因子(AlDREB2和AlTINY)，并對其進(jìn)行生物學(xué)信息分析。對中華蘆薈進(jìn)行各種逆境脅迫，分析AlDREB2和AlTINY基因在各種脅迫下的表達(dá)變化。主要研究結(jié)果如下： 1、AlDREB2和AlTINY基因的克隆。 通過DREB轉(zhuǎn)錄因子家族的保守序列設(shè)計簡并引物，以中華蘆薈DNA和cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增獲得保守序列。根據(jù)獲得的保守序列設(shè)計特異引物，通過3'YRACE方法

4、擴(kuò)增獲得3'端序列，利用PCR—Walking法擴(kuò)增得到5'端序列。最后分別獲得兩條含有完整ORF框的基因序列。設(shè)計引物同時以DNA和cDNA為模板擴(kuò)增獲得的大小相同的片段，表明AlDREB2和AlTlNY基因均無內(nèi)含子。 2、AlDREB2和AlTINY生物信息學(xué)分析。 AlDREB2基因的cDNA序列為886bp，ORF框大小為636bp，編碼211個氨基酸。AlTINY基因的cDNA序列為718bp，ORF框大小

5、為552bp，編碼183個氨基酸。在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明，AlDREB2與庫拉索蘆薈的DREB1相似性最高。AlTINY與擬南芥的TINY2相似性最高。AlDREB2和AlTINY蛋白具有典型的AP2/EREBF的DNA結(jié)構(gòu)域和DREB類轉(zhuǎn)錄因子位于保守結(jié)構(gòu)域第14位的功能氨基酸頡氨酸(V)。進(jìn)化樹分析將AlDREB2歸為DREB轉(zhuǎn)錄因子的A-6亞組，A1TNY歸為DREB轉(zhuǎn)錄因子的A-4亞組，同源分析也表明A1DRE

6、B2具有A-6亞組除了AP2/EREBP的DNA保守結(jié)構(gòu)域外的另外兩個保守區(qū)域，A1TINY具有在保守結(jié)構(gòu)域的第15位氨基酸為絲氨酸(S)，這與同屬于A-4亞組的擬南芥TINY和TINY2相同。在A1DREB2的C—端具有潛在的酸性活化區(qū)域，AlTINY的C端酸性氨基酸含量豐富，推測為活化調(diào)控區(qū)。信號肽預(yù)測顯示AlDREB2和AlTINY都沒有信號肽序列，亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示AlDREB2最有可能定位于線粒體基質(zhì)，而AlTINY最有可能定

7、位于細(xì)胞核。 3、AlDRB2和AlTINY基因的表達(dá)分析。 通過對中華蘆薈幼苗進(jìn)行干旱脅迫、高鹽脅迫、低溫脅迫、ABA和乙烯利誘導(dǎo)處理，分析AlDREB2和A1TINY基因在不同脅迫下的表達(dá)變化。結(jié)果表明兩個基因雖然同屬于DREB轉(zhuǎn)錄因子，但在不同脅迫下的表達(dá)變化具有較大的差異。AlDREB2在未處理時幾乎不表達(dá)，對干旱和低溫脅迫比對高鹽脅迫更敏感， ABA誘導(dǎo)后也迅速表達(dá)，在乙烯利誘導(dǎo)下也能夠表達(dá)，但是表達(dá)出現(xiàn)的時間