G蛋白偶聯(lián)受體介導雄激素對前列腺癌細胞快速作用的非基因組機制.pdf

1、目的：體外研究G蛋白偶聯(lián)受體介導的雄激素(雙氫睪酮，DHT)對人前列腺癌PC3細胞內(nèi)Ca2+水平及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性產(chǎn)生的快速非基因組效應，并探討其機制。方法：應用鈣熒光指示劑Fura-2/AM檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)；Westernblot方法檢測MAPK家族成員(ERK1/2、JNK和p38)的活化水平；MTTassay檢測DHT快速作用對細胞增殖的影響。結果：DHT可以在一定范圍內(nèi)濃度依賴性地誘導PC

2、3細胞[Ca2+]i快速升高，而且也能快速誘導ERK1/2、JNK的磷酸化，但是對p38的磷酸化卻表現(xiàn)為快速的抑制作用；當細胞外無Ca2+或使用L-型鈣離子通道阻斷劑預處理細胞，DHT不能誘導這種快速效應；用AR拮抗劑醋酸環(huán)丙氯地孕酮預處理細胞，對該快速效應無影響；用蛋白合成抑制劑放線菌酮預處理細胞，DHT仍能誘導[Ca2+]i快速升高；用睪酮-牛血清白蛋白復合物(短期內(nèi)不能穿過細胞膜)刺激細胞，仍能誘導[Ca2+]i快速升高；用G蛋白

3、抑制劑百日咳毒素或GDPβs預處理細胞，能明顯阻斷DHT誘導的快速效應；DHT短暫的脈沖式刺激對PC3細胞的增殖具有一定的促進作用。結論：雄激素對前列腺癌細胞存在著由細胞膜G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)介導的快速非基因組效應。雄激素通過GPCR能促使細胞膜L-型電壓門控通道開放，引起胞外Ca2+內(nèi)流，導致胞內(nèi)Ca2+濃度的快速升高，然后進一步引起MAPK激酶活性的快速變化。DHT通過非基因組作用快速調(diào)節(jié)MAPK激酶活性可能是其促進PC3細胞

4、增殖的機制之一。這種雄激素快速作用的非基因組機制可能在前列腺癌的惡性演變過程中扮演著一個重要的角色，同時對前列腺癌的治療也具有重要的臨床價值。 研究背景：雄激素在體內(nèi)具有重要的生理功能，能促進男性的第二性征的發(fā)育和成熟以及男性生殖器官的維持和精子的發(fā)生。傳統(tǒng)的觀點認為，人體內(nèi)主要的雄激素睪酮(T)和它的代謝產(chǎn)物5α-雙氫睪酮(DHT)一般是通過經(jīng)典的基因組機制發(fā)揮它們的生物效應，即雄激素進人靶細胞后和胞內(nèi)雄激素受體(AR)結合，使

5、AR活化形成二聚體，然后作用于特定的基因位點或其它轉錄相關因子，進而影響mRNA的表達和蛋白質(zhì)的合成。通過這種機制發(fā)揮作用的特點是起效慢而持續(xù)時間長。前列腺癌的激素治療正是以此為理論依據(jù)。然而除了這種基因組作用模式，有越來越多的證據(jù)顯示：雄激素對機體多種組織和細胞存在不依賴傳統(tǒng)基因組途徑的快速作用，例如快速誘導細胞內(nèi)游離鈣離子(Ca2+)的增加。這種快速作用不經(jīng)過胞內(nèi)受體，也不涉及任何基因的轉錄或蛋白質(zhì)的合成，屬于一種非基因組作用機制。

6、這種非基因組的作用機制與傳統(tǒng)的基因組作用機制相比較具有如下特點：①起效時間短，往往在數(shù)秒至數(shù)分鐘即出現(xiàn)效應；②雄激素受體拮抗劑、DNA轉錄和蛋白合成抑制劑均不能阻斷該作用；③雄激素與大分子物質(zhì)(如BSA)偶聯(lián)后短時間內(nèi)不能進人細胞，但仍能發(fā)揮其快速效應。因此，研究雄激素在前列腺癌細胞中的非基因組作用機制以及這種快速作用對腫瘤細胞功能的影響，有助于我們進一步揭示前列腺癌的惡性演變過程，同時對前列腺癌的治療也具有重要的臨床價值。 目

7、的：體外研究雄激素(雙氫睪酮，DHT)對人前列腺癌PC3細胞內(nèi)Ca2+水平及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性產(chǎn)生的快速非基因組效應，并探討其機制。同時觀察這種快速作用對細胞增殖的影響。 方法：復蘇、培養(yǎng)人前列腺癌PC3細胞株。應用鈣熒光指示劑Fura-2/AM和MiraCalimagesystem檢測DHT對PC3細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的快速影響；用Westernblot方法檢測MAPK家族成員(ERK1/2、JN

8、K和p38)的磷酸化水平，觀察DHT對PC3細胞內(nèi)MAPK激酶活性的快速調(diào)節(jié)作用；MTTassay檢測DHT快速作用對前列腺癌PC3細胞增殖的影響。 結果：1、DHT可以誘導PC3細胞內(nèi)[Ca2+]i快速升高，同時也能快速誘導ERK1/2、JNK的磷酸化，但是對p38的磷酸化卻表現(xiàn)為快速的抑制作用。DHT濃度在10-7～10-9M時這種快速作用依次減弱，并呈劑量-效應關系。10-6MDHT引起的快速效應與10-7MDHT相比無明

9、顯差異。DHT濃度在10-9M時沒有引起細胞內(nèi)[Ca2+]i和MAPK活性的明顯變化。2、當細胞外無Ca2+時，DHT不能誘導細胞內(nèi)[Ca2+]i快速升高，而且使用L-型鈣離子通道阻斷劑verapamil、diltiazem和nifedipine預處理細胞也可抑制DHT誘導的[Ca2+]i快速升高效應，但使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RyR抑制劑普魯卡因和磷脂酶C抑制劑新霉素對該快速效應無影響。3、在細胞外無Ca2+的條件下，DHT也不能引起ERK1/2、

10、JNK和p38磷酸化水平的快速變化。4、用雄激素受體拮抗劑醋酸環(huán)丙氯地孕酮預處理細胞，對DHT誘導[Ca2+]i快速升高和快速調(diào)節(jié)MAPK激酶活性的效應均無影響。5、使用蛋白合成抑制劑放線菌酮預處理細胞后，DHT仍能誘導[Ca2+]i快速升高。6、用睪酮-牛血清白蛋白復合物(T-BSA，短期內(nèi)不能穿過細胞膜)刺激細胞后，仍能誘導細胞內(nèi)[Ca2+]i快速升高。7、使用G蛋白抑制劑百日咳毒素(PTX)或GDPβs預處理細胞，能明顯阻斷DHT

11、對細胞內(nèi)[Ca2+]i和MAPK激酶活性的快速作用。8、用1μMDHT刺激PC3細胞兩次，每次持續(xù)20min，兩次時間間隔2h，然后用去激素的小牛血清繼續(xù)培養(yǎng)細胞48h后檢測增殖情況，與對照組相比，單次DHT刺激沒有引起細胞數(shù)的明顯改變，但給予兩次(脈沖式)刺激后細胞數(shù)有顯著增加。 結論：1、DHT能夠誘導前列腺癌PC3細胞內(nèi)[Ca2+]i快速升高，并對細胞內(nèi)MAPK激酶活性產(chǎn)生快速的調(diào)節(jié)作用，這種快速效應在一定范圍內(nèi)具有濃度依

12、賴性。2、胞內(nèi)快速增加的Ca2+來源于細胞外的Ca2+通過細胞膜L-型電壓門控通道內(nèi)流，細胞內(nèi)鈣庫未參與作用。3、DHT對細胞內(nèi)ERK1/2、JNK和p38磷酸化水平的快速調(diào)節(jié)作用是Ca2+依賴的，胞內(nèi)[Ca2+]i的快速升高是MAPK激酶活性產(chǎn)生快速變化的必要條件。4、DHT引起的這種快速效應不是通過經(jīng)典AR介導的，其過程中不需要蛋白質(zhì)合成，而是通過非基因組機制完成的，與G蛋白的活化密切相關。5、該快速效應是通過細胞膜上雄激素結合位點

13、介導的，這種細胞膜上的雄激素結合位點屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)或同G蛋白偶聯(lián)受體的功能密切相關。6、DHT通過短暫的脈沖式刺激對PC3細胞的增殖產(chǎn)生了一定的促進作用，提示DHT可以通過快速的非基因組作用促進前列腺癌PC3細胞的增殖。7、DHT通過非基因組途徑對MAPK激酶活性的快速調(diào)節(jié)可能是其影響PC3細胞增殖的機制之一。8、這種雄激素快速作用的非基因組機制可能在前列腺癌的惡性演變過程中起著重要的作用，同時對前列腺癌的治療也具有重要