microRNA-185負(fù)向調(diào)控雄激素受體抑制前列腺癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)特性的作用機(jī)制研究.pdf

1、前列腺癌(canccrofprostate)是歐美國(guó)家最常見的惡性腫瘤之一，占第二位。在美國(guó)，前列腺癌的發(fā)病率占首位，死亡率僅次于肺癌。中國(guó)等亞洲國(guó)家前列腺癌遠(yuǎn)低于歐美，但是其發(fā)病率呈現(xiàn)顯著增長(zhǎng)的趨勢(shì)。前列腺癌的病因至今尚未闡明，激素假說獲得了較為廣泛的支持。前列腺的生長(zhǎng)依賴雄激素的作用，前列腺癌細(xì)胞的增殖也有賴于雄激素的生物學(xué)作用。因此，目前對(duì)于前列腺癌的治療措施中除根治性前列腺癌切除術(shù)等手術(shù)治療外，最大阻斷雄激素(MAB)為最主要的

2、方法，即手術(shù)切除睪丸+氟他胺+促黃體激素釋放激素促效劑(LHRH-A)聯(lián)合應(yīng)用，以期達(dá)到雄激素的最大阻斷，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)。
　　 盡管MAB能夠達(dá)到很好的抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的目的，仍有部分前列腺癌會(huì)進(jìn)展為另一階段：激素非依賴性前列腺癌。激素非依賴性前列腺癌不依賴雄激素的生物學(xué)作用，在此階段前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)通過其他方式增殖、遷移和侵襲。由激素依賴性前列腺癌進(jìn)展為激素非依賴性前列腺癌的具體機(jī)制尚未闡明，目前主要存在四

3、種觀點(diǎn)：雄激素受體表達(dá)上調(diào)、雄激素受體基因突變、配體非依賴性激活和共調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。由此可見，雄激素受體在前列腺癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要的作用。雄激素作用的發(fā)揮主要是通過與雄激素受體結(jié)合來啟動(dòng)下游信號(hào)通路。雄激素受體信號(hào)通路的下游分子多種多樣，其生物學(xué)功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等等。最常見的例子便是其下游分子PSA的高表達(dá)可以促使前列腺細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，雄激素受體參與了前列腺癌的進(jìn)展過程，因此如果能夠采取干預(yù)措施抑制雄激

4、素受體的生物學(xué)作用，則可以有效抑制前列腺癌的發(fā)展。進(jìn)一步講，通過有效干預(yù)雄激素受體的功能，有助于抑制前列腺癌由激素依賴性前列腺癌進(jìn)展為激素非依賴性前列腺癌。
　　 MicroRNAs為內(nèi)源性、非編碼性的小的核苷酸片段，長(zhǎng)度一般為22～25nt。近年來，有關(guān)microRNA對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)控作用一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。MicroRNAs能夠與mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合，從而阻遏mRNA的翻譯功能，甚至直接降解mRNA，這兩方面

5、作用都能夠抑制蛋白的合成，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中同樣發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，可以表現(xiàn)為癌基因發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的作用，也可以表現(xiàn)為抑癌基因發(fā)揮抑制腫瘤的作用。由此可見，如若采取相應(yīng)的干預(yù)手段上調(diào)或者下調(diào)相應(yīng)microRNAs的水平，可以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-185(縮寫為miR-185)在諸多腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，例如直腸癌、卵巢癌等

6、等，但是有關(guān)其在前列腺癌中的作用至今未見報(bào)道。鑒于雄激素受體在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展和激素非依賴性前列腺癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要的作用，我們擬研究miR-185與雄激素受體是否存在相應(yīng)的調(diào)控關(guān)系以及miR-185是否能夠干預(yù)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 一、miR-185在臨床PCa組織中的低表達(dá)以及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和靶點(diǎn)驗(yàn)證
　　 我們首先檢測(cè)了miR-185在臨床前列腺癌標(biāo)本和癌旁正常組織中的表達(dá)情況。首先，microRNA芯片分

7、析發(fā)現(xiàn)miR-185在前列腺癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)。然后取前列腺癌和前列腺癌旁正常組織各25例，部分凍存，部分用中性福爾馬林固定。病理切片HE染色證實(shí)所取組織為前列腺癌或正常前列腺上皮組織。凍存標(biāo)本經(jīng)RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增和qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-185在前列腺癌組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織。這一結(jié)果提示miR-185可能參與了前列腺癌的腫瘤發(fā)展過程。在此基礎(chǔ)上，我們利用TargetScan5.2algorithm(www

8、.targetscan.org)預(yù)測(cè)miR-185的作用靶點(diǎn)。結(jié)果令人興奮的是，雄激素受體的3’UTR存在miR-185的潛在作用靶點(diǎn)，其作用位點(diǎn)為173-179nt。之后，我們利用雙熒光報(bào)告載體，驗(yàn)證了miR-185與雄激素受體的靶向作用關(guān)系，結(jié)果證實(shí)miR-185確實(shí)能夠結(jié)合雄激素受體的3’UTR區(qū)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低，從而證實(shí)了預(yù)測(cè)結(jié)果?；瘜W(xué)合成miR-185mimics(miR-185m)和對(duì)照microRNAnegativec

9、ontrol(miR-NC)，利用INTERFERin將化學(xué)合成物轉(zhuǎn)染入LNCaP細(xì)胞，之后檢測(cè)雄激素受體AR和前列腺特異性抗原PSA的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-185m促使AR蛋白的表達(dá)顯著降低。同時(shí)，PSA的表達(dá)也顯著降低，表現(xiàn)在mRNA和蛋白兩個(gè)水平。上述結(jié)果從基因和蛋白水平證實(shí)了miR-185對(duì)雄激素受體的靶向作用。
　　 二、miR-185高表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響
　　 在本部分實(shí)驗(yàn)中，

10、我們重點(diǎn)研究miR-185對(duì)前列腺癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)特性的影響。我們選擇了雄激素受體表達(dá)強(qiáng)陽性的LNCaP細(xì)胞株作為研究對(duì)象。首先進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代，其中總結(jié)了關(guān)于LNCaP培養(yǎng)過程中的經(jīng)驗(yàn)。之后化學(xué)合成miR-185mimics(miR-185m)和對(duì)照microRNAnegativecontrol(miR-NC)，利用轉(zhuǎn)染試劑INTERFERin將化學(xué)合成物轉(zhuǎn)染入LNCaP細(xì)胞。PCR證實(shí)轉(zhuǎn)染效率足夠研究要求。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，利用

11、日本同仁化學(xué)研究所的CCK-8試劑盒，連續(xù)檢測(cè)測(cè)轉(zhuǎn)染后5天的LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-185m后LNCaP細(xì)胞的增殖受到顯著抑制。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，我們采用劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-185m顯著削弱了LNCaP細(xì)胞的腫瘤遷移能力。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-185m后，穿過8微米細(xì)孔的LNCaP細(xì)胞顯著減少，提示其腫瘤侵襲能力顯著降低。為探求miR-185對(duì)LNCaP細(xì)胞周期的影響，我們利用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢

12、測(cè)了轉(zhuǎn)染miR-185m后細(xì)胞各周期的的比率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-185m后細(xì)胞被阻滯在G1期，S期的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，說明miR-185能夠起到G1/S阻滯的作用。上述研究證實(shí)：miR-185能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，主要是通過細(xì)胞周期G1/S阻滯實(shí)現(xiàn)；miR-185能夠減弱前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力，提示其顯著的腫瘤抑制作用。
　　 三、miR-185高表達(dá)對(duì)裸鼠皮下前列腺癌腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響
　　 在本部分實(shí)

13、驗(yàn)中，我們重點(diǎn)研究經(jīng)miR-185m轉(zhuǎn)染的LNCaP細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。為使得轉(zhuǎn)染能夠穩(wěn)定傳代，我們將miR-185m進(jìn)行2'ome修飾。轉(zhuǎn)染后將106個(gè)LNCaP細(xì)胞用100μL的PBS溶液重懸，注入裸鼠皮下。經(jīng)過6周的生長(zhǎng)，測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腫瘤的重量、大小以及腫瘤中雄激素受體的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過miR-185m轉(zhuǎn)染后，LNCaP細(xì)胞的致瘤作用顯著減弱，主要表現(xiàn)為腫瘤的大小和重量較對(duì)照組顯著降低，另外western-bl

14、otting證實(shí)腫瘤中AR的表達(dá)也顯著降低。8周后解剖發(fā)現(xiàn)，裸鼠肝臟出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，比較發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miR-185的LNCaP細(xì)胞所形成的轉(zhuǎn)移性肝結(jié)節(jié)顯著少于對(duì)照組。上述研究證實(shí)miR-185在裸鼠體內(nèi)同樣具有腫瘤抑制作用。
　　 綜合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，我們得出以下結(jié)論：miR-185可以作為“tumorsuppressor”抑制前列腺細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)特性，此作用的發(fā)揮依靠miR-185直接作用于雄激素受體。由miR-185過表