miR--34a沉默逆轉(zhuǎn)靡爛性毒物對角質(zhì)形成細(xì)胞遷移抑制的作用及機(jī)制的實(shí)驗研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　微小RNA(miRNA)是機(jī)體一類重要的基因表達(dá)調(diào)控分子，通過與靶mRNA的3'-UTR區(qū)域不完全配對結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄和翻譯，與機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、DNA損傷修復(fù)、凋亡和腫瘤發(fā)生等眾多生物學(xué)事件密切相關(guān)。miR-34a是p53誘導(dǎo)的miRNA，在DNA損傷應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。芥子氣(sulfur mustard，SM)是皮膚損傷劑，引起皮膚炎癥、紅斑、水皰等病理改變，創(chuàng)面愈合緩慢。目前的研究結(jié)果認(rèn)為芥子

2、氣對DNA的損傷作用是其引起病理變化的分子基礎(chǔ)。我們推測，miR-34a的表達(dá)改變可能在SM對皮膚損傷過程中發(fā)揮作用，干預(yù)其表達(dá)可能會對皮膚的損傷及愈合有影響。因此，本研究中我們用miR-34a的抑制物Ago34a抑制角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)水平，觀察芥子氣模擬物CEES(2-chloroethyl ethyl sulfide，2—氯乙基乙硫醚)染毒后，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移、粘附、侵襲等指標(biāo)的改變，以期明確m

3、iR-34a在硫芥損傷的保護(hù)作用，并對遷移，粘附，侵襲相關(guān)蛋白以及激動蛋白聚合狀態(tài)(F-actin)等進(jìn)行檢測，以闡明其作用機(jī)制。研究結(jié)果可為后續(xù)在體研究，如使用miR-34a沉默藥物治療芥類毒物皮膚難愈損傷，提供實(shí)驗資料。
　　方法:
　　第一部分 CEES染毒HaCaT細(xì)胞miR-34a的變化
　　1.CEES染毒HaCaT細(xì)胞模型建立及評價:采用不同CEES劑量(0.2，0.5，1.0，2.0mM)進(jìn)行染毒，染毒

4、后6h使用MTS法檢測細(xì)胞活性，確定后續(xù)試驗染毒的最佳劑量（該劑量對細(xì)胞活性有影響，但細(xì)胞可以耐受）。采用該劑量在染毒后24h光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　2.細(xì)胞分化標(biāo)志物檢測:根據(jù)上述的毒性實(shí)驗結(jié)果，確定0.5mM CEES為最佳染毒劑量，使用該劑量染毒24h后，采用基底細(xì)胞未分化標(biāo)志物角質(zhì)蛋白5(K5)和分化標(biāo)志物角質(zhì)蛋白10(K10)對染毒后細(xì)胞的分化情況進(jìn)行檢測，以1.2mM Ca2+誘導(dǎo)分化處理作為陽性對照。
　　

5、3.用stem-loop Q-PCR法檢測成熟miRNA:使用商品化的miRNA檢測用引物，檢測方法與試劑與Q-PCR檢測mRNA類似。在正式的miRNA檢測前，利用溶解曲線評價miRNA檢測引物的質(zhì)量，同時比較U6和5S作為內(nèi)參在本染毒模型上的穩(wěn)定性。
　　第二部分 miR-34a沉默對CEES染毒前/后細(xì)胞遷移，粘附的影響
　　1.化學(xué)合成miRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗:通過轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗對轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行評價。用cy3熒光標(biāo)記和未標(biāo)記的

6、miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察cy3陽性細(xì)胞率。miR-34a沉默采用的是商品化的miR-34a沉默(Ago34a)。
　　2.Western blotting:實(shí)驗設(shè)計為6組，分組如下，miR-34a沉默轉(zhuǎn)染組(Ago34a)和對照抑制劑轉(zhuǎn)染(Ago ctr)組，0.5mM CEES染毒miR-34a沉默轉(zhuǎn)染組，0.5mM CEES染毒對照抑制劑轉(zhuǎn)染組(Ago34a+0.5)，p38抑制劑干預(yù)0.5mM CEES染毒miR-34

7、a沉默轉(zhuǎn)染組(Ago34a+0.5+P38 inh)，ERK1/2抑制劑干預(yù)0.5mM CEES染毒miR-34a沉默轉(zhuǎn)染組(Ago34a+0.5+ERK1/2 inh)，染毒后24h檢測EGFR，ERK1/2總蛋白，以及p38和ERK1/2磷酸化水平。
　　3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗:實(shí)驗分組同上。用于評價各種處理因素下細(xì)胞運(yùn)動遷移的能力。
　　4.細(xì)胞粘附實(shí)驗:實(shí)驗分組同上。用于評價各種處理因素下細(xì)胞粘附底物的能力。
　　5

8、.細(xì)胞侵襲實(shí)驗:實(shí)驗分組同上。用于評價各種處理因素下細(xì)胞穿透基質(zhì)膠(Matrixgel)的能力。
　　6.免疫熒光染色F-actin:實(shí)驗分組同上。F-actin反映actin的聚合程度，與細(xì)胞骨架重塑、遷移、粘附等有關(guān)。本實(shí)驗用于觀察各種處理因素下細(xì)胞內(nèi)F-actin的分布和熒光強(qiáng)弱。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)分析F-actin:實(shí)驗分組同上。用于準(zhǔn)確反映各種處理因素下細(xì)胞F-actin的平均熒光強(qiáng)度。
　　8.Weste

9、rn Blotting:實(shí)驗分組同上。主要檢測各種處理因素下與遷移相關(guān)的蛋白（miR-34a的靶蛋白或非靶蛋白）的改變。
　　9.生物信息學(xué)分析:與遷移相關(guān)的蛋白HDAC6，在miR-34a沉默后增加。使用TargetScan預(yù)測和Vector NTI手工比對，預(yù)測HDAC63'-UTR的可能miR-34a結(jié)合位點(diǎn)。
　　第三部分 miR-34a沉默促CEES染毒細(xì)胞遷移的其它因素
　　1.流式細(xì)胞術(shù)檢測胞膜蛋白Int

10、egrinβ1:實(shí)驗分組同前。檢測了和細(xì)胞粘附，遷移相關(guān)Integrinβ1可能和細(xì)胞黏附，遷移相關(guān)。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量:實(shí)驗分組同前。檢測了和Integrinβ1改變相關(guān)的Ca2+含量。
　　3.HPLC能量代謝檢測:實(shí)驗分組同上。檢測了可能和細(xì)胞遷移相關(guān)的能量代謝的變化。
　　4.Western Blotting檢測COX-10:實(shí)驗分組同上。結(jié)果反映能量代謝中氧化磷酸化功能酶的含量變化。<

11、br>　　結(jié)果:
　　1.在本實(shí)驗室建立了CEES體外染毒模型，發(fā)現(xiàn)0.5 mM CEES是最佳染毒劑量。該劑量下染毒HaCaT可以觀察到細(xì)胞粘附、遷移和侵襲能力均降低。部分功能和結(jié)構(gòu)蛋白如K5、iNOS、MMP-1、Fra-1降低顯著，Integrinβ1略有增加。
　　2.0.5 mM CEES染毒可以顯著降低HaCaT細(xì)胞K5(基底細(xì)胞marker)。但形態(tài)學(xué)和K10的WB結(jié)果表明，并未有明顯的細(xì)胞分化跡象。
　

12、　3.建立了穩(wěn)定的stem-loop Q-PCR法檢測成熟miRNANA，比較了U6和5S兩個內(nèi)參的穩(wěn)定性（后者更佳），以此法檢測了miR-34a在CEES染毒HaCaT細(xì)胞內(nèi)隨時間后劑量變化后的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-34a在0.2，0.5mM CEES染毒后12h-24h表達(dá)增加，至24h增加3倍左右，該調(diào)控是通過該細(xì)胞的突變p53來實(shí)現(xiàn)的。
　　4.建立了高轉(zhuǎn)染效率的miRNA轉(zhuǎn)染方法。miR-34a沉默可以增加細(xì)胞遷移和粘附能力

13、。同樣，miR-34a沉默使0.5 mM CEES染毒細(xì)胞遷移增加，該遷移能力的變化可以被p38和ERK1/2信號通路抑制劑所降低。miR-34a沉默并未使0.5 mM CEES染毒細(xì)胞粘附增加。
　　5.miR-34a沉默引起0.5 mM CEES染毒后一些遷移相關(guān)靶蛋白及信號通路激酶磷酸化增加，如c-myc、c-Met、ARHGAP1、HDAC6，以及p38和ERK1/2的磷酸化。遷移相關(guān)的信號蛋白iNOS增加依賴于ERK1/

14、2通路激活。Fra-1作為已報道的miR-34a靶蛋白未見增加。
　　6.miR-34a沉默并未顯著改變0.5 mM CEES染毒細(xì)胞MMP-1，Integrinβ1，Ca2+含量和能量代謝水平。
　　7.miR-34a沉默顯著增加染毒前/后遷miR-34a沉默引起0.5 mM CEES染毒細(xì)胞的ERK1/2信號通路激活，經(jīng)過ERK1/2抑制劑處理后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的分化狀態(tài)。伴隨著胞內(nèi)Ca2+濃度和Integrinβ1的明顯

15、增加。
　　結(jié)論及展望:
　　miR-34a沉默可以顯著增加遷移，并可以部分逆轉(zhuǎn)CEES染毒引起的細(xì)胞遷移降低。miR-34a沉默后引起染毒細(xì)胞遷移增強(qiáng)的作用機(jī)制可能是:(1) p-p38和p-ERK1/2信號通路的激活;(2)c-Met蛋白表達(dá)增強(qiáng)，促使該通路的激活;(3)miR-34a靶蛋白ARHGAP1增加，可能引起下游遷移相關(guān)蛋白Rho GTPase增加;(4)HDAC6蛋白增加可能使骨架蛋白和組蛋白去乙?；?br