骨髓單個核細(xì)胞移植治療腦出血大鼠的實驗研究.pdf

1、背景和目的：
　　腦出血(intra cerebral hemorrhage，ICH)是指原發(fā)性非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)出血，發(fā)病率為每年60-80/10萬，在我國占全部腦卒中的20％-30％，急性期病死率30％-40％，并且即使患者幸存下來，也會遺留偏癱等神經(jīng)功能障礙。近年來很多學(xué)者嘗試用干細(xì)胞移植治療ICH，其中包括神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、臍帶血單個核細(xì)胞等，大多都取得了良好的效果。
　　骨髓單個核細(xì)胞(bon

2、e marrow mono nuclear cells，BMMNCs)是指在形態(tài)學(xué)上細(xì)胞核為單個核的一類細(xì)胞的總稱，其包括有包括了造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitorcells，EPSs)等，系異質(zhì)性細(xì)胞群。這些細(xì)胞具有自我更新及多向分化潛能，能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)

3、樣細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等。由于骨髓單個核細(xì)胞具有來源豐富方便、功能多樣、無需體外培養(yǎng)、移植費用低廉、自體移植無免疫排斥反應(yīng)和倫理問題等優(yōu)點，骨髓單個核細(xì)胞被越來越多的用于治療缺血性疾病的治療。并且，對于心肌梗死、腦梗死等缺血性疾病的一期臨床研究中骨髓單個核細(xì)胞的應(yīng)用也越來越多。但是，對于出血性疾病的治療，骨髓單個核細(xì)胞卻鮮有報道。本課題通過尾靜脈移植骨髓單個核細(xì)胞治療腦出血大鼠，觀察其對腦出血大鼠腦水腫和神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，進(jìn)一步

4、觀察骨髓單個核細(xì)胞在腦內(nèi)的存活和分化情況，并探討其治療大鼠腦出血的可能機(jī)制。
　　材料和方法：
　　健康成年SD大鼠240只由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，用于骨髓單個核細(xì)胞的標(biāo)記、提取及腦出血模型的建立。60只大鼠連續(xù)腹腔注射BrdU(50mg/kg)14天標(biāo)記骨髓單個核細(xì)胞，通過密度梯度離心法提取骨髓單個核細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色檢測提取的骨髓單個核細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀鑒定骨髓單個核細(xì)胞表面分化抗原CD34、CD45、CD90。采用

5、立體定向技術(shù)向尾狀核內(nèi)注射Ⅶ型膠原酶構(gòu)建SD大鼠腦出血模型，并分組（sham組、PBS組、BMMNCs組），通過尾靜脈移植骨髓單個核細(xì)胞，于移植后第1天、3天、7天、14天觀察神經(jīng)損害嚴(yán)重程度評分(mNSS)并評價腦組織含水量;于移植后第7天甲酚紫染色觀察皮層神經(jīng)元密度;于移植后第28天在熒光顯微鏡下觀察骨髓單個核細(xì)胞在腦內(nèi)的存活、遷移、分布和分化情況。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)用(X)±S表示，神經(jīng)損害嚴(yán)重

6、程度評分采用重復(fù)測量的方差分析，腦組織含水量和大腦皮層神經(jīng)元密度的比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.提取的骨髓單個核細(xì)胞為懸浮的單個、球形懸浮細(xì)胞群，臺盼藍(lán)染色活性細(xì)胞（未著色細(xì)胞）＞97％;BMMNCs標(biāo)記率及CD34、CD45、CD90表面分化抗原陽性率分別為:(72.0±3.1)％、(21.5±2.6)％、(50.1±3.0)％、(85.3±2.6)％。

7、r>　　2.多變量方差分析表明，與PBS組相比，骨髓單個核細(xì)胞可以促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，在第3天、7天、14天神經(jīng)功能恢復(fù)尤為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。單因素方差分析表明，BMMNCs移植組大鼠在第3、7d腦組織含水量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。腦出血后第7天甲酚紫染色表明，雖然PBS組和BMMNCs組大鼠皮層神經(jīng)元密度均小于sham組(128.6±2.7)，但BMMNCs組大鼠病灶側(cè)大腦皮層神

8、經(jīng)元較PBS組排列整齊，水腫較輕，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，并且相同單位面積陽性細(xì)胞數(shù)目(73.0±2.4)較PBS組(50.5±1.9)明顯增多(P＜0.01)。
　　3.細(xì)胞移植后第28天通過免疫熒光技術(shù)檢測表明，BMMNCs能夠進(jìn)入腦出血大鼠腦組織內(nèi)，存活并且往血腫周圍遷移，分化為神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1、BMMNCs能夠明顯促進(jìn)腦出血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，顯著減輕腦水腫，并改善大腦皮層神經(jīng)元損害程度。