生物鐘基因Per2、Bmal1在腫瘤細(xì)胞系Raji、Hut、OCI-LY8及HL-60中的晝夜表達(dá)規(guī)律.pdf

1、研究目的
　　探索血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系中生物鐘基因Bmal1及Per2在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況，明確體外培養(yǎng)條件下的血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系中是否存在生物鐘基因轉(zhuǎn)錄水平上的晝夜波動(dòng)，并對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行以時(shí)間為變量的余弦函數(shù)擬合，以預(yù)測(cè)體外培養(yǎng)條件下生物鐘基因轉(zhuǎn)錄的高峰和低谷時(shí)段，為進(jìn)一步研究血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)生、發(fā)展與鐘基因的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。
　　研究對(duì)象和方法
　　1研究對(duì)象
　　1)人伯基特淋巴瘤Raji細(xì)胞系;2）

2、人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤Hut-78細(xì)胞系;3)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤OCI-LY8細(xì)胞系;4）髓系白血病HL-60細(xì)胞系。
　　2方法
　　2.1細(xì)胞培養(yǎng)
　　四種細(xì)胞系分別接種于含10％胎牛血清的RIPA1640培養(yǎng)基，并在C02、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，間隔2-3天換液。
　　2.2生物鐘基因節(jié)律表達(dá)的同步誘導(dǎo)
　　細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)（對(duì)數(shù)期內(nèi)）更換含0.5％胎牛血清的RIPA1640培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)2天，饑餓培

3、養(yǎng)后更換培養(yǎng)基為50％胎牛血清的PIRA1640培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行血清休克誘導(dǎo)同步節(jié)律的產(chǎn)生，并將此時(shí)刻時(shí)間記為ZT0，2小時(shí)后更換無(wú)血清培養(yǎng)基。按照時(shí)間順序，將ZT0時(shí)刻后4小時(shí)計(jì)為ZT4，8小時(shí)后計(jì)為ZT8，以此類推。
　　2.3測(cè)定mRNA含量
　　在ZT(0、4、8、12、16、20、24)時(shí)刻分別使用Trizol提取不同細(xì)胞系的總RNA，檢測(cè)RNA純度和完整性;使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA;應(yīng)用Real-timePCR

4、定量測(cè)定Per2、Bmal1mRNA的表達(dá)。
　　2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　將目的基因的Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值△Ct作為基因的相對(duì)表達(dá)水平。對(duì)同種細(xì)胞同種基因在不同時(shí)間點(diǎn)的△Ct值進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)符合條件的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，P＜0.05為差異具有顯著性。通過(guò)方差分析判定差異有顯著性的基因則進(jìn)行余弦節(jié)律擬合。應(yīng)用余弦分析軟件和CronoLab軟件獲取節(jié)律性參數(shù)，用于擬合的余弦函數(shù)

5、方程為F(t)=M+Acos（ωt+φ）其中M為中值;A為節(jié)律震蕩的振幅;φ為峰值相位，是震蕩達(dá)到峰值的時(shí)刻所換算出的角度，根據(jù)ω角度(360°/24h)可將其換算成ZT時(shí)點(diǎn)
　　結(jié)果
　　1.血清休克法節(jié)律誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞中生物鐘基因Bmal1在一天內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01)，認(rèn)為無(wú)法通過(guò)血清休克法誘導(dǎo)Raji細(xì)胞內(nèi)Bmal1基因的節(jié)律性表達(dá);血清休克法可誘導(dǎo)的OCI-LY8、Hut-78、HL-

6、60細(xì)胞中生物鐘基因Bmal1與Per2及Raji細(xì)胞中生物鐘基因Per2在一天內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)mRNA轉(zhuǎn)錄水平存在晝夜節(jié)律性，且這種細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因表達(dá)的節(jié)律性可用余弦函數(shù)來(lái)進(jìn)行的大致描述;
　　2.應(yīng)用余弦分析軟件及CronoLab軟件進(jìn)行余弦方程擬合，將同種細(xì)胞同種基因轉(zhuǎn)錄mRNA的量在一天內(nèi)的相對(duì)變化情況擬合為以時(shí)間t（小時(shí)）為變量的余弦函數(shù)，可得余弦方程為:OCI-LY8細(xì)胞轉(zhuǎn)錄Bmal1可擬合為F(t)=13.9+5.4c

7、os(15t)，轉(zhuǎn)錄Per2可擬合為F(t)=9.6+4.1cos(22.5t+90);Hut-78細(xì)胞轉(zhuǎn)錄Bmal1可擬合為F(t)=10.6+6.0cos(45t+180)，轉(zhuǎn)錄Per2可擬合為F(t)=7.5+5.0cos(15t+180);HL-60細(xì)胞轉(zhuǎn)錄Bmal1可擬合為F(t)=18.9+3.5cos(22.5t+180)，轉(zhuǎn)錄Per2可擬合為F(t)=7.0+3.6coS(15t+240);Raji細(xì)胞轉(zhuǎn)錄Per2可擬合

8、為F(t)=9.6+3.6cos(15t+180);
　　3.通過(guò)余弦函數(shù)可知OCI-LY8的Bmal1基因轉(zhuǎn)錄水平大致以24小時(shí)為波動(dòng)周期，其峰值時(shí)段和谷值時(shí)段分別位于ZT0和ZT12，Per2基因的轉(zhuǎn)錄水平大致以16小時(shí)為波動(dòng)周期，其峰值時(shí)段和谷值時(shí)段分別位于ZT12和ZT4;Hut-78細(xì)胞的Bmal1基因轉(zhuǎn)錄水平大致以8小時(shí)為波動(dòng)周期，其峰值時(shí)段和谷值時(shí)段分別位于ZT4和ZT8，Per2基因的轉(zhuǎn)錄水平大致以24小時(shí)為波動(dòng)周

9、期，其峰值時(shí)段和谷值時(shí)段分別位于ZT12和ZT0;HL-60細(xì)胞Bmal1基因的轉(zhuǎn)錄水平大致以16小時(shí)為波動(dòng)周期，其峰值時(shí)段和谷值時(shí)段分別位于ZT0和ZT8，Per2基因的轉(zhuǎn)錄水平大致以24小時(shí)為波動(dòng)周期，其峰值時(shí)段和谷值時(shí)段分別位于ZT8和ZT20;Raji細(xì)胞Per2基因的轉(zhuǎn)錄水平大致以24小時(shí)為波動(dòng)周期，其峰值時(shí)段和谷值時(shí)段分別位于ZT12和ZT0;
　　結(jié)論
　　1.體外培養(yǎng)條件下可通過(guò)血清休克法誘導(dǎo)生物鐘基因Bma