生物鐘基因Per1、Per2在體外調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物節(jié)律及放療作用的研究.pdf

1、目的：探索生物鐘基因per1,per2在不同時(shí)間段對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和NIH3T3生物節(jié)律性及放療調(diào)控作用，研究per1,per2在過表達(dá)狀態(tài)下對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞放療的凋亡率以及增殖能力的影響.
　　方法：利用PMA刺激誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞產(chǎn)生晝夜節(jié)律。分別取4h,8h,12h,16h,20h,24h等不同時(shí)段膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞，應(yīng)用Real-timePCR在轉(zhuǎn)錄水平上定量觀察

2、膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞在同一時(shí)間點(diǎn)上Period1(Per1),Period2(Per2)的表達(dá)差異及不同時(shí)間點(diǎn)上同一種細(xì)胞上Period1(Per1),Period2(Per2)兩種基因表達(dá)的差異。
　　取4h,8h,12h,16h,20h,24h等不同時(shí)段膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞，給予PI染色后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)下，上述2種細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況。
　　利用直線加速器，在4h,8h,12h,

3、16h,20h,24h等不同時(shí)段對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行照射，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，觀察其放射敏感性差異。同時(shí)利用CFSE檢測(cè)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞在不同時(shí)段照射后膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞的增殖情況。
　　采取脂質(zhì)體介導(dǎo)法，分別將per1,per2真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Per1,pcDNA3.1(+)-Per2轉(zhuǎn)染入細(xì)胞體內(nèi)。48小時(shí)后，利用直線加速器照射細(xì)胞。利用流式細(xì)胞

4、儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡及增殖情況。
　　結(jié)果：per2基因在C6和NIH3T3細(xì)胞中都可以呈現(xiàn)明顯的節(jié)律性，且振蕩節(jié)律約為23-24小時(shí)之間；在這種節(jié)律表達(dá)中，rper2的表達(dá)峰值在ZT1，28，谷值在ZT16，40，其中最高點(diǎn)在ZT28,最低點(diǎn)在ZT16并且這種節(jié)律振幅隨時(shí)間的延續(xù)越來越小。而mper2的表達(dá)峰值在ZT1,24,表達(dá)谷值在ZT12,36；最高點(diǎn)在ZT1，最低點(diǎn)在ZT12，其節(jié)律振幅同樣隨時(shí)間的延續(xù)而變小。mper1在N

5、IH3T3細(xì)胞中同樣有著明顯的節(jié)律性且同mper2節(jié)律基本一致；而rper1則近日節(jié)律不明顯，但呈持續(xù)的高表達(dá)。
　　在膠質(zhì)瘤細(xì)胞，rper2表達(dá)高值的時(shí)間點(diǎn)，即在ZT24點(diǎn)G2/M期的細(xì)胞數(shù)明顯多于其他時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)目；而在ZT16點(diǎn)位于C6細(xì)胞絕大多數(shù)都阻滯在G0/G1和S期。而NIH3T3細(xì)胞則無類似現(xiàn)象。在接受射線照射后，在rper2表達(dá)的高值時(shí)間點(diǎn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組及其他時(shí)間點(diǎn)組；而NIH3T3細(xì)胞則結(jié)果相

6、反。CFSE活性熒光染料檢測(cè)增殖則提示，在rper2基因表達(dá)谷值時(shí)段，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于其他時(shí)間點(diǎn)；而NIH3T3細(xì)胞則在per1、per2基因表達(dá)的谷值，增殖能力最弱。
　　轉(zhuǎn)染后rper2過表達(dá)的C6細(xì)胞在接受射線照射后的凋亡率明顯高于，rper1過表達(dá)組及對(duì)照組，且增殖能力也明顯小于rper1過表達(dá)組及對(duì)照組。NIH3T3細(xì)胞的mper1及mper2過表達(dá)組之間，凋亡率并無差異卻低于對(duì)照組；增殖能力二者也無明顯差異，且