鈣網(wǎng)織蛋白在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移作用的影響的研究.pdf

1、目的：
　　 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性、進(jìn)行性、侵襲性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)，以周身關(guān)節(jié)滑膜炎及血管翳形成為主要病理特征的全身性自身免疫性疾病。其發(fā)病機(jī)制尚不是十分清楚，有研究報(bào)道鈣網(wǎng)織蛋白(Calreticulin，CRT)可能參與了RA的病理機(jī)制。本研究采用多種免疫學(xué)方法分析CRT在RA患者血清、滑液以及滑膜中的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析CRT在RA發(fā)病機(jī)制中的潛在作用;鑒于NO作為RA

2、發(fā)病過(guò)程中發(fā)生炎癥反應(yīng)和血管新生的主要參與者，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討CRT如何通過(guò)NO參與RA發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法：
　　 1.本研究選取標(biāo)本全部選自2010年2月至2011年10月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染免疫科和天津醫(yī)院關(guān)節(jié)外科中心，血清標(biāo)本:活動(dòng)期RA44例;骨性關(guān)節(jié)炎(OA)16例;系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(SLE)25例;其他自身免疫性疾病24例，包括:干燥綜合征11例，強(qiáng)直性脊柱炎5例，系統(tǒng)性硬皮病4例，血清

3、陰性脊柱關(guān)節(jié)病2例，銀屑病性關(guān)節(jié)炎和軟骨炎各1例;同時(shí)選取性別、年齡相匹配的30名健康體檢者作為健康對(duì)照。關(guān)節(jié)滑膜和滑液標(biāo)本:RA7例，OA14例。
　　 2.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)RA、OA、SLE、其他自身免疫性疾病及健康對(duì)照血清中CRT含量;同時(shí)檢測(cè)RA、OA關(guān)節(jié)滑液中的CRT含量。
　　 3.采用蛋白免疫印跡(Western blot)方法鑒定血清中CRT的存在形式。
　　 4.病理學(xué)方法

4、檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織中CRT的表達(dá)。
　　 5.采用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)體外培養(yǎng)，檢測(cè)CRT對(duì)NO產(chǎn)生的影響。
　　 6.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRT對(duì)HUVECs增殖的作用。
　　 7.劃痕實(shí)驗(yàn)分析CRT對(duì)HUVECs遷移的作用。
　　 數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x)±s表示，數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，采用單因素方差分析和Student-Newman-Kenls檢驗(yàn)進(jìn)

5、行統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.RA患者類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)為（88.0±61.4）IU/ML;C反應(yīng)蛋白(CRP)（5.7±6.0）mg/dl;血沉(ESR)（43.1±18.2）mm/h。OA患者RF（12.7±7.8）IU/ML;CRP（3.6±2.5）mg/dl; ESR（26.5±27.0）mm/h。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者RF(52.9±34.6)IU/ML; CRP(5.

6、6±5.5)mg/dl; ESR(42.7±16.3)mm/h。其他自身免疫性疾病對(duì)照組患者RF(40.5±25.9) IU/ML; CRP（5.5±6.0）mg/dl; ESR（42.2±11.1）mm/h。健康對(duì)照組CRP（0.6±0.5）mg/dl; ESR(12.3±13.4) mm/h。RA組與其他各組在年齡及性別構(gòu)成等方面均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2.RA組血清中CRT含量[(4.817±2.423)n

7、g/ml]高于OA組[(3.574±0.923)ng/ml]、SLE組[(4.013±1.524)ng/ml]、其他自身免疫性疾病組[(3.882±0.842)ng/ml]以及健康對(duì)照組[(3.726±0.619) ng/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。RA組與OA組滑液中CRT含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.Western blot結(jié)果顯示，CRT在血清中僅見(jiàn)單體一種形式。RA組積分光密度值明顯高于健康對(duì)照、OA、和SLE組(P＜0.0

8、5)。Western blot檢測(cè)結(jié)果與ELISA一致，即CRT在RA血清中的表達(dá)明顯增高。
　　 3.病理學(xué)結(jié)果顯示RA滑膜組織中可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，CRT呈現(xiàn)高表達(dá)，主要位于滑膜組織的襯里層和襯里下層、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及血管周?chē)?在OA，CRT僅在襯里層及血管周?chē)袠O少量的表達(dá)。
　　 4.HUVECs在含有TNF-α的高糖DMEM培養(yǎng)后，內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的水平較對(duì)照組明顯升高。實(shí)驗(yàn)得出20ng/ml的TNF-α即為

9、有效刺激HUVECs產(chǎn)生NO分泌的濃度。在10％胎牛血清完全高糖DMEM培養(yǎng)液加入不同濃度CRT培養(yǎng)24h后，NO的釋放水平較對(duì)照組均有顯著增高，且NO的分泌量隨CRT濃度的改變呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。
　　 5.MTT實(shí)驗(yàn)顯示，CRT對(duì)HUVECs的增殖沒(méi)有明顯作用;劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRT可以促進(jìn)HUVECs遷移和創(chuàng)傷愈合的作用，NO在HUVECs遷移過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.RA血清中CRT的含量