溶瘤病毒對(duì)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用.pdf

1、[背景和目的]惡性腫瘤是人類(lèi)最常見(jiàn)的死因之一,隨著診療技術(shù)的不斷提高,腫瘤患者的總體生存率有了顯著提高,但對(duì)于一部分腫瘤患者,如大腸癌、肺癌等,生存率的改善仍不明顯,需要進(jìn)一步尋找新的治療方法.腫瘤生物治療是目前腫瘤治療的研究熱點(diǎn)之一,溶瘤病毒是利用突變病毒基因或利用腫瘤特異性啟動(dòng)子控制病毒腫瘤特異性復(fù)制,進(jìn)而達(dá)到選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的一類(lèi)病毒.目前已用腫瘤特異性啟動(dòng)子構(gòu)建了多種溶瘤病毒,但是由于在這些載體中運(yùn)用了組織特異性的啟動(dòng)子,它們

2、的抗腫瘤范圍被限制在特定種類(lèi)的癌癥,不具廣譜抗腫瘤性.端粒酶是染色體末端復(fù)制時(shí)所需的一種酶,它在85﹪以上的腫瘤細(xì)胞中是活性增高的,而在絕大多數(shù)體細(xì)胞中是失活的,這提示端粒酶啟動(dòng)子在腫瘤靶向性生物治療中具有良好的應(yīng)用價(jià)值.基于以上原理,構(gòu)建了hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)E1基因和GFP基因表達(dá)的腺病毒載體Ad/hTERT-GFP-E1,以達(dá)到腫瘤特異性復(fù)制和腫瘤靶向性治療的目的.在本實(shí)驗(yàn)中將選用多種大腸癌細(xì)胞,通過(guò)測(cè)定細(xì)胞活力來(lái)檢驗(yàn)該腺病毒載體

3、在體外的抗腫瘤作用,并探討其抗腫瘤的機(jī)制及進(jìn)一步的應(yīng)用. [實(shí)驗(yàn)方法]用293細(xì)胞擴(kuò)增各重組腺病毒,通過(guò)氯化銫密度梯度離心法純化腺病毒;TCID<,50>法測(cè)定病毒滴度及其體外復(fù)制能力;熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP的表達(dá);MTT法及細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)檢驗(yàn)該病毒在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的殺傷作用;用原位細(xì)胞凋亡試劑盒對(duì)病毒感染后的細(xì)胞行凋亡檢測(cè),各處理組間的差異采用配對(duì)的t檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估. [結(jié)果]1)腺病毒體外復(fù)制能力的測(cè)定:

4、用Ad/hTERT-GFP-E1及Ad/CMV-GFP感染DLD1細(xì)胞48h后,在光鏡下見(jiàn)Ad/hTERT-GFP-E1感染的DLD1細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),在熒光顯微鏡下觀察到有明顯的GFP表達(dá),感染了Ad/CMV-GFP的DLD1細(xì)胞中也可見(jiàn)GFP表達(dá),但細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化,而感染這兩種病毒的正常人成纖維細(xì)胞(NHFB)細(xì)胞未見(jiàn)任何CPE且僅見(jiàn)極少量的GFP表達(dá);一周后取以上細(xì)胞裂解液感染DLD1細(xì)胞,結(jié)果顯示用感染Ad/h

5、TERT-GFP-E1的DLD1裂解液再次感染48h后仍可見(jiàn)明顯的CPE及GFP表達(dá),而其他的細(xì)胞裂解液均未造成類(lèi)似的效果.對(duì)上述裂解液進(jìn)行TCID50測(cè)定后結(jié)果表明DLD1細(xì)胞感染Ad/hFERT-GFP-E1的裂解液后病毒滴度明顯高于感染Ad/CMV-GFP的裂解液,而在NHFB細(xì)胞分別感染上述兩種病毒的裂解液后病毒滴度無(wú)明顯差異.2)溶瘤病毒對(duì)大腸癌細(xì)胞的體外殺傷作用:選擇不同滴度的病毒感染正常細(xì)胞(NHFB)及大腸癌細(xì)胞(DID

6、1、HCT8、LOVO、SWll6、HCT116),5天后MTT法測(cè)定其細(xì)胞活力,結(jié)果表明Ad/hTERT-GFP-E1對(duì)NHFB沒(méi)有殺傷作用,而對(duì)大腸癌細(xì)胞均有明顯的殺傷作用,而且殺傷作用與病毒濃度存在劑量依賴(lài)關(guān)系,Ad/CMV-GFP對(duì)以上腫瘤細(xì)胞都無(wú)明顯的抑制作用;用250MOI的兩種病毒分別感染LOVO和NHFB后,在第3、5、7、9天測(cè)定細(xì)胞活力,結(jié)果顯示Ad/hTERT-GFP-E1對(duì)LOVO的殺傷作用隨作用時(shí)間增加而增強(qiáng),

7、而NHFB細(xì)胞的相對(duì)活力與感染時(shí)間不存在相關(guān)性;細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)結(jié)果也顯示Ad/hTERT-GFP-E1能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成,該抑制作用存在劑量依賴(lài)關(guān)系.3)、凋亡檢測(cè):分別用500MOI的Ad/htERT-GFP-E1及Ad/CMV-GFP感染DLD1細(xì)胞48小時(shí)后用原位細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行凋亡檢測(cè),結(jié)果顯示Ad/hTERT-GFP-E1作用后細(xì)胞凋亡率較Ad/CMV-GFP及PBS處理后明顯增加,細(xì)胞計(jì)數(shù)后的結(jié)果顯示:PBS組

8、、Ad/CMV-GFP組、Ad/hTERT-GFP-E1組的凋亡率為分別為1.44±0.15﹪、1.75±0.47﹪、10.75±1.24﹪,Ad/hTERT-GFP-E1所引起的凋亡率顯著高于其他兩個(gè)對(duì)照組. [結(jié)論]1)溶瘤腺病毒Ad/hTERT-GFP-E1能夠選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,并且能夠在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持較高的病毒滴度;2)Ad/hTERT-GFP-E1能夠選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞,而對(duì)人正常纖維細(xì)胞都沒(méi)有毒性作用;3)溶