轉(zhuǎn)染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列的BHK-21細胞沉默病毒復制研究.pdf

1、登革病毒(dengue rivus，DENV)屬于黃病毒科(Flavivirade)黃病毒屬(Flavivirus)，由其感染所引起的疾病包括:登革熱(dengue fever，DF)，登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合癥(dengue shocksyndrome，DSS)。嚴重的登革出血熱（登革出血熱和登革休克綜合癥），20世紀50年代在菲律賓和泰國登革熱流行期間被首次確認[1]。截止

2、至2012年11月WHO報告，近幾十年來，世界各地的登革熱發(fā)病率大幅增長。世界上二分之一的人口，非洲，美洲，東地中海，東南亞和西太平洋地區(qū)超過100個國家處于登革熱流行的威脅中，2008年，美洲、東南亞和西太平洋地區(qū)的國家登革熱病毒感染報告病例數(shù)120萬，而到2010年，報告病例數(shù)上升至230萬，最近報告病例仍在持續(xù)增加。登革熱不僅發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，而且暴發(fā)疫情的地區(qū)也呈擴大化的趨勢，以前從未發(fā)現(xiàn)過登革熱疫情的國家遭受登革病毒的

3、威脅[3,4]。登革熱在2012年被WHO列為傳播速度最快的媒介傳播病毒性疾病，它具有在世界上出現(xiàn)流行的可能性。全世界需要改變應對方式，并實施可持續(xù)性預防措施。登革熱成為全球關(guān)注的熱點。
　　 目前控制登革熱的方法主要是用化學方法控制傳播媒介，這種方法對登革病毒的預防和控制發(fā)揮了舉足輕重的作用。然而，隨著殺蟲劑等化學制劑的廣泛應用，這種方法亦產(chǎn)生許多的負面影響:蚊蟲產(chǎn)生抗藥基因，破壞環(huán)境—化學制劑殘留于環(huán)境中。同時，由于熱帶和亞

4、熱帶地區(qū)城市化進程加快以及國際間交流的增加導致白紋伊蚊活動范圍擴大[5-7]，登革病毒的疫區(qū)產(chǎn)生擴大化趨勢。因而，有學者指出，應對登革病毒傳播需要有效的新策略。如加緊致力于新型有效疫苗的研發(fā)，通過基因修飾或操縱傳播媒介等。通過基因修飾傳播媒介，改變病毒感染的宿主易感性，從而達到媒介中病毒復制的降低或消除，這種方法稱為源于病原體的抵抗(pathogen-derived resistance，DPR)[8-9]。DPR最早在植物中發(fā)現(xiàn)，合成

5、的煙草花葉病毒外殼蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的表達有效地保護了植物來自同源病毒的攻擊。這種現(xiàn)象后來被命名為RNA干擾效應。RNA干擾是指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，RNAi被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于生物界，從低等原核生物、真菌、無脊椎動物、哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)了此種現(xiàn)象。RNAi抗病毒的效應已在多種媒介昆蟲中發(fā)現(xiàn)，Ronald P.van Rij[10]等發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅中RNAi途徑中關(guān)鍵酶Ago-2缺陷株體內(nèi)病毒RNA呈高水平累積;Va

6、rgas[11]等通過敲除RNAi途徑中的AGO-2、Dcr-2和R2D2的表達后，能增加登革Ⅱ型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復制。有研究者已開始利用RNAi干擾的技術(shù)修飾或改造媒介，使得媒介減少攜帶或者不攜帶病毒。Anthony KG等[12-14]通過引入dsRNA已成功用于抑制西尼羅河病毒(WNV)、日本腦炎病毒（JEV）和黃熱病毒(YFV)的復制;Franz AW等[15-16]經(jīng)短片段RNA(short interfering RNA

7、，siRNA)改造的轉(zhuǎn)基因蚊有效地阻止病毒的感染和傳播;Zhang等[17]通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)至哺乳動物細胞內(nèi)，對DENV-2復制產(chǎn)生干擾效應，抑制病毒的復制。RNAi有望成防控登革病毒感染的新策略。
　　 登革病毒的基因組為單股正鏈RNA分子，約含11000個堿基，具有單一的可讀框，編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白和七種非結(jié)構(gòu)蛋白，其編碼基因順序為:5'-C-prM-E-NS1-N

8、S2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3'。其中prM蛋白的切割被認為是未成熟病毒顆粒向成熟病毒顆粒轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟，與病毒的裝配、成熟和維持病毒的感染性有關(guān)[18-19]。因而，prM被許多研究者選為觸發(fā)RNAi的效應基因。成功介導RNAi還需穩(wěn)定高效的表達系統(tǒng)。質(zhì)粒作為載體導入效應基因有以下優(yōu)點:可以使用不同的選擇性標志;通過構(gòu)建可誘導的表達系統(tǒng)，可長期穩(wěn)定進行基因表達;進行大規(guī)?；蚝Y選的成本低[20]。本研究利用能

9、在多種哺乳動物細胞中高效表達的真核表達載pcDNA3.1(+)，把登革Ⅱ型病毒前膜蛋白反向重復序列克隆到該表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染至登革病毒易感性高的BHK-21中初步探討干擾病毒復制的效果，半定量PCR和實時熒光定量PCR分析評價其抑制病毒復制的效果，為防控登革病毒感染的新策略提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1.構(gòu)建RNAi表達載體:將登革Ⅱ型病毒前膜蛋白反向重復序列克隆至能在多種哺乳動物細胞中高效表達的真核表達載

10、體pcDNA3.1(+)中。
　　 2.構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP，轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，測定轉(zhuǎn)染效率。
　　 3.轉(zhuǎn)染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復序列至BHK-21細胞，半定量PCR和實時熒光定量PCR評價重組質(zhì)粒抑制病毒復制的效果。
　　 方法:
　　 1.乳鼠內(nèi)接種登革Ⅱ型病毒，提取病毒total RNA。
　　 2.正義和反義引物兩端分別加上XhoⅠ和EcoRⅠ的識別位點，以提取

11、的totalRNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增的prM全長基因片段插入pcDNA3.1(+)中，形成含有prM反向序列的重組質(zhì)粒pcDNA-asprM。
　　 3.于另一對正義和反義引物兩端引入酶切位點NheⅠ和BglⅡ，經(jīng)RT-PCR擴增prM全長基因片段插入pMD18-T-vector中，形成含有正向序列的重組質(zhì)粒pMD18-T-prM。
　　 4.限制性內(nèi)切酶NheⅠ和KpnⅠ分別酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-prM和

12、重組質(zhì)粒pcDNA-asprM，得到片段prM和線性化載體pcDNA-asprM，連接構(gòu)建成含有prM反向重復序列的重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA。
　　 5.擴增增強型熒光蛋白基因片段(eGFP)，克隆至pcDNA3.1(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP。
　　 6.重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　 7.BHK-21細胞繁殖登革Ⅱ型病毒，收集病毒液。
　　 8

13、.免疫熒光檢測登革病毒感染BHK-21細胞。
　　 9.TCID50方法測定收集的病毒液滴度。
　　 10.篩選的陽性重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA和空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中。
　　 11.登革Ⅱ型病毒攻擊細胞，染毒后不同時間收集細胞total RNA。
　　 12.半定量PCR檢測NS3基因的表達，以評估病毒復制水平。
　　 13.實時熒光定量PCR檢測細胞

14、內(nèi)病毒載量，評估細胞內(nèi)病毒復制水平。
　　 14.實時熒光定量PCR檢測NS1基因表達，評估病毒復制水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.收集接種登革Ⅱ型病毒乳鼠鼠腦病毒液并提取病毒RNA。
　　 2.RT-PCR反應擴增前膜蛋白全長基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，可見單一條帶，擴增效果較好，其大小約600bp，與理論值基本相符，測序結(jié)果提交至NCBI進行比對，同源性達97％。
　　 3.構(gòu)建的重組

15、載體pMD18-T-prM，pcDNA-asprM和含有prM反向重復序列的重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶進行酶切均可見特異的酶切條帶。
　　 4.成功擴增增強型熒光蛋白基因eGFP序列，經(jīng)測序證實重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP中的eGFP cDNA序列與質(zhì)粒pEGFP-N質(zhì)粒(Gene blank accession:#U55762)中的EGFP cDNA序列一致，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP。

16、　　 5.成功在本室建立登革Ⅱ型病毒感染BHK-21細胞模型，收集病毒液經(jīng)TCID50測得的滴度為106.48TCID50/0.1 ml。
　　 6.重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP轉(zhuǎn)染BHK-21后，在細胞內(nèi)有增強型熒光蛋白表達，并初步測定轉(zhuǎn)染率:在24h、48h、72h和96h轉(zhuǎn)染率分別為36.3％、45.0％、31.6％和31.3％。
　　 7.在不同時間點收集經(jīng)DENV-2攻擊的實驗組、空白對照組和陽性對照組細胞中

17、的RNA，半定量PCR檢測NS3mRNA的表達。擴增的NS3基因電泳帶存在明顯差異。Glyko BandScan分析NS3和內(nèi)參GAPDH灰度的比值，結(jié)果顯示，48hpi和60hpi，實驗組、空白對照組和陽性對照組的NS3mRNA表達量基本相同，在96hpi，實驗組和陽性對照組間mRNA表達量存在差異，實驗對照組的NS3表達水平比陽性對照組降低28％。
　　 8.建立熒光定量PCR檢測DENV2的方法:擴增NS1基因和內(nèi)參GAP

18、DH，陽性擴增曲線整體平行性好，基線平坦，曲線光滑，拐點清楚，呈S形，重復性好;收集的溶解曲線峰型單一，只有一個主峰。表明所采用的反應體系和引物的擴增效率、特異性和模板的量都是合適的;利用登革Ⅱ型病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因，構(gòu)建了檢測登革Ⅱ型病毒的標準品，在標準曲線的基礎(chǔ)上，可以檢測出待測標本中病毒的拷貝數(shù)。
　　 9.在不同時間點收集經(jīng)DENV-2攻擊的實驗組和陽性對照組BHK-21細胞中的RNA，應用FQ-PCR檢測細胞內(nèi)病

19、毒載量的變化。結(jié)果顯示，在48hpi內(nèi)，實驗組和對照組細胞內(nèi)病毒載量變化不大，在72hpi，兩組細胞內(nèi)病毒載量達到峰值，但實驗組病毒量與對照組相比，病毒拷貝數(shù)少1.44倍。在96hpi，實驗組病毒載量比陽性對照組病毒載量降低26.7％。
　　 10.在不同時間點收集經(jīng)DENV-2攻擊的實驗組和陽性對照組BHK-21細胞中的RNA，應用FQ-PCR檢測細胞內(nèi)NS1表達水平的差異。歸一化值結(jié)果顯示病毒感染96h后，實驗組中NS1表達