CD147在惡性黑素色瘤細胞糖酵解過程中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖酵解能力增強是腫瘤能量代謝的基本特征。乳酸是糖酵解過程的主要代謝產(chǎn)物，腫瘤細胞中過量產(chǎn)生的乳酸通過轉(zhuǎn)運載體(MCT)轉(zhuǎn)運至胞外引起微環(huán)境中pH值下降，進而增強腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成。CD147是一種在多種腫瘤細胞膜上有增高表達的新型跨膜糖蛋白，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮與和低pH值微環(huán)境幾乎相同的作用。有研究證實CD147在腫瘤細胞膜上與MCT共存并控制其表達，可能參與乳酸轉(zhuǎn)運。
　　 惡性

2、黑素瘤具有生長速度快、易于發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點，是惡性程度較高的皮膚腫瘤之一，其皮損外周的pH值在6.4-7.3之間，低于正常皮膚pH值。同時惡性黑素瘤細胞的侵襲和肺轉(zhuǎn)移能力在低pH環(huán)境中明顯增強。因此，本研究旨在明確CD147分子是否與MCT分子共同參與惡性黑素瘤細胞能量代謝，為CD147分子成為皮膚腫瘤基因治療的靶分子提供更堅實的理論基礎。
　　 研究目的：
　　 1.探討CD147分子是否參與了惡性黑素瘤細胞糖酵解轉(zhuǎn)運。

3、
　　 2.探討CD147分子參與糖酵解的機制。
　　 3.探討CD147分子參與糖酵解過程的后續(xù)作用。
　　 研究方法
　　 1.運用免疫印跡方法檢測正常黑素細胞NHMC，惡性黑素瘤細胞株A375中CD147，MCT1和MCT4的表達水平。
　　 2.運用免疫熒光共聚焦顯微技術(shù)觀察A375細胞上CD147分別和MCT1、MCT4的表達共存情況。
　　 3.利用pSUPER/CD147si

4、RNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染惡性黑素瘤細胞株A375。
　　 4.運用免疫印跡法觀察CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對A375細胞中MCT1和MCT4表達的影響。
　　 5.運用免疫熒光共聚焦顯微技術(shù)觀察CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對A375細胞膜上MCT1和MCT4的表達及其與CD147共存的影響。
　　 6.應用紫外分光光度計檢測CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對A375細胞糖酵解過程中乳酸轉(zhuǎn)運的影響。
　　 7.應用Sar

5、torius pH計測定CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對A375細胞外微環(huán)境中pH值的影響。
　　 8.運用熒光素-熒光素酶方法檢測CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對A375細胞中ATP水平的影響。
　　 9.運用MTT方法、Transwell小室和ELISA方法細胞生物學和分子生物學常規(guī)法分別觀察CD147 siRNA以及外源性乳酸對腫瘤細胞增殖、侵襲、VEGF表達的影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.正常黑素細

6、胞NHMC中未檢測到CD147、MCT1和MCT4的表達，而惡性黑素瘤細胞株A375中CD147，MCT1和MCT4有明顯表達。
　　 2.A375細胞中CD147分子分別與MCT1、MCT4在細胞膜上表達共存。
　　 3.成功構(gòu)建了A375細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPER/CD147siRNA重組質(zhì)粒后的細胞克隆C1和C2，pSUPER-vector空轉(zhuǎn)為對照。
　　 4.與A375細胞比較，C1和C2細胞胞漿和胞膜上

7、的MCT1、MCT4分子表達均顯著下降，且與CD147在胞膜上的共表達下調(diào)。
　　 5.NHMC細胞培養(yǎng)上清中幾乎未檢測到乳酸，而A375細胞培養(yǎng)上清中有顯著增高的乳酸產(chǎn)生。與A375細胞比較，C1和C2細胞外微環(huán)境中乳酸水平顯著下降至27.2％和22.4％，而pSUPER-vector空轉(zhuǎn)組細胞(A375-vector)外乳酸水平無明顯變化。
　　 6.A375細胞外pH值為7.19左右，顯著低于NHMC細胞外水平(p

8、＜0.001)。CD147siRNA干擾了CD147的表達后，其胞外pH值增高，C1和C2細胞中分別約為7.36和7.34。
　　 7.與A375細胞比較，C1和C2細胞內(nèi)ATP的水平顯著下降，分別下降到了60.8％和51.9％(p＜0.001)。而pSUPER-vector空轉(zhuǎn)組細胞(A375-vector)內(nèi)的ATP水平與A375細胞相比無顯著性差異。
　　 8.與A375細胞比較，C1和C2細胞的增殖能力、侵襲能力

9、以及VEGF的表達水平均顯著下降。但C1和C2細胞中加入了20mM外源性乳酸后，其增殖能力、侵襲能力以及VEGF的表達水平均有一定程度的恢復。
　　 結(jié)論：
　　 1.CD147分子增強了惡性黑素瘤細胞的糖酵解能力。
　　 2.CD147分子可能通過影響惡性黑素瘤細胞中MCT1和MCT4在細胞膜上的表達而參與腫瘤細胞的乳酸轉(zhuǎn)運。
　　 3.CD147分子可能通過下調(diào)腫瘤細胞外pH值影響惡性黑素瘤細胞增殖、