紫草素抑制IL-23誘導(dǎo)銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-17的研究.pdf

1、前言
　　 銀屑病的發(fā)病機(jī)制與近年新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群-Th17關(guān)系密切。目前研究顯示IL-23/Th17細(xì)胞通路是銀屑病發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一。紫草系傳統(tǒng)中藥,具有涼血、活血、解毒、透疹之功效,治療銀屑病的療效已被臨床肯定[4]。紫草素屬于萘醌類化合物,為紫草發(fā)揮藥理作用的主要成分,常被作為治療銀屑病的主要藥物,但其作用機(jī)制尚不清楚。為此,我們將探討紫草素對(duì)IL-23誘導(dǎo)銀屑病患者PBMCs產(chǎn)生IL-6、IL-17的影

2、響。
　　 材料和方法
　　 一、研究對(duì)象
　　 (一)病例組
　　 銀屑病患者20例,均來自2009年10月至2010年3月期間中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者,其中男12例,女8例,年齡23～55歲,平均年齡40.9±10.9歲。
　　 (二)對(duì)照組
　　 健康志愿者11例,其中男5例,女6例,年齡27～50歲,平均年齡32.1±4.8歲?；颊呒爸驹刚呷虢M前均簽署知情同意書。
　

3、　 (三)入組標(biāo)準(zhǔn)
　　 1、近三個(gè)月未用任何治療銀屑病及免疫抑制性藥物
　　 2、無腫瘤及其他自身免疫性基礎(chǔ)疾病
　　 3、近兩周無感染病史
　　 4、疾病處于進(jìn)展期
　　 (四)排除標(biāo)準(zhǔn)
　　 1、年齡>60歲或<20歲
　　 2、近三個(gè)月應(yīng)用治療銀屑病或免疫抑制性藥物
　　 3、有腫瘤或自身免疫性疾病
　　 4、近兩周有感染病史
　　 5、疾病處于靜

4、止期或消退期
　　 二、試劑
　　 重組人白介素23(rIL-23)購自BD/Pharminen公司。IL-23ELISA檢測試劑盒購自R&D公司。IL-17ELISA檢測試劑盒購自CUSABIO BIOTECH Co.Ltd公司。IL-6ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德公司。CCK-8購自日本同仁化學(xué)研究所。紫草素購自日本和光公司(WAKO)。環(huán)孢素A購自德國Merk公司。RPMI1640培養(yǎng)液和PBS緩沖液購自Hy

5、clone公司。Ficoll液購自GE-healthcare bio-sciences AB公司。DMSO購自solarbio公司。
　　 三、方法
　　 (一)藥物處理
　　 10mg紫草素溶于1mlDMSO,雙蒸水定容,細(xì)胞培養(yǎng)液中DMSO終濃度<0.5％。100mg的環(huán)孢素溶于1mlDMSO,雙蒸水定容,細(xì)胞培養(yǎng)液中DMSO終濃度<0.5％。
　　 (二)ELISA法檢測血清IL-23的含量

6、　　 取銀屑病患者及健康志愿者外周靜脈血,離心分離血清,操作步驟參照試劑盒的說明書進(jìn)行。
　　 (三)PBMCs的分離
　　 將銀屑病患者外周靜脈血用Ficoll進(jìn)行密度梯度離心,將獲得的PBMCs充分洗滌后,用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整PBMCs的密度為6×108/L。
　　 (四)細(xì)胞培養(yǎng)
　　 將上述調(diào)整密度后的PBMCs細(xì)胞培養(yǎng)于48孔板中,每孔850μL,每個(gè)培養(yǎng)條件設(shè)3個(gè)復(fù)孔,在不同的刺激條

7、件下置于37℃、50ML/L CO2孵箱中培養(yǎng)。
　　 (五)細(xì)胞毒性分析
　　 不同刺激條件下的PBMCs培養(yǎng)72h后收集細(xì)胞,將收集的各孔細(xì)胞計(jì)數(shù)后用100μLRPMI1640重懸,放入96孔板中,每孔均加入CCK-8(10μL),置于37℃、50ML/L CO2孵箱中培養(yǎng)4小時(shí)后,酶聯(lián)免疫檢測儀測OD(450nm)。按公式:細(xì)胞存活率(％)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％計(jì)算細(xì)胞存活率。As:實(shí)驗(yàn)孔(

8、含細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、紫草素),Ac:對(duì)照孔(含細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、無紫草素),Ab空白孔(不含細(xì)胞和毒性物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8)。
　　 (六)ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-17的含量
　　 不同刺激條件下的PBMCs培養(yǎng)72h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,操作步驟參照試劑盒的說明書進(jìn)行。
　　 結(jié)果
　　 (一)病例組較對(duì)照組血清中IL-23的含量顯著升高
　　 與對(duì)照

9、組相比,病例組血清中IL-23的含量顯著升高。
　　 (二)IL-23誘導(dǎo)銀屑病患者PBMCs產(chǎn)生IL-17
　　 10ng/ml、50ng/ml及100ng/ml IL-23與PBMCs共培養(yǎng)后,IL-23可誘導(dǎo)PBMCs產(chǎn)生IL-17。
　　 (三)紫草素對(duì)銀屑病患者PBMCs產(chǎn)生IL-17及細(xì)胞存活率的影響
　　 ≤2ug/ml紫草素與PBMCs共培養(yǎng)后,可以劑量依賴的方式增加PBMCs產(chǎn)生IL-1

10、7。5ug/ml、7.5ug/ml、10ug/ml紫草素與PBMCs共培養(yǎng)后,產(chǎn)生IL-17的增加隨紫草素劑量的增加而減少。12.5ug/ml、20ug/ml、30ug/ml紫草素與PBMCs共培養(yǎng)后,可以劑量依賴的方式減少IL-17的產(chǎn)生。與medium相比,≤12.5ug/ml紫草素與PBMCs共培養(yǎng)后,細(xì)胞存活率無明顯下降,20ug/ml及30ug/ml紫草素與PBMCs共培養(yǎng)72h后,細(xì)胞存活率顯著降低。
　　 (四)紫

11、草素對(duì)IL-23誘導(dǎo)銀屑病患者PBMCs產(chǎn)生IL-17及細(xì)胞存活率的影響
　　 PBMCs與IL-23共培養(yǎng)后,IL-23可誘導(dǎo)PBMCs產(chǎn)生IL-17,當(dāng)加入7.5、10、12.5及20 ug/ml紫草素均可抑制IL-23誘導(dǎo)IL-17的產(chǎn)生。與medium相比,7.5ug/ml、10 ug/ml、12.5ug/ml紫草素與IL-23及PBMCs共培養(yǎng)后,細(xì)胞存活率無明顯下降,20ug/ml紫草素與IL-23及PBMCs共培養(yǎng)

12、72h后,細(xì)胞存活率顯著降低。
　　 (五)環(huán)孢素對(duì)IL-23誘導(dǎo)銀屑病患者PBMCs產(chǎn)生IL-17及細(xì)胞存活率的影響
　　 PBMCs與IL-23共培養(yǎng)后,IL-23可誘導(dǎo)PBMCs產(chǎn)生IL-17,加入7.5、12.5、20、30及50ug/ml環(huán)孢素均可抑制IL-23誘導(dǎo)IL-17的產(chǎn)生。與medium相比,7.5、12.5、20、30ug/ml環(huán)孢素與IL-23及PBMCs共培養(yǎng)后,細(xì)胞存活率無明顯下降,而50u咖

13、l環(huán)孢素與IL-23及PBMCs共培養(yǎng)72h后,細(xì)胞存活率顯著降低。
　　 (六)紫草素抑制IL-23誘導(dǎo)銀屑病患者PBMCs產(chǎn)生IL-6、IL-17,及對(duì)細(xì)胞存活率的影響
　　 PBMCs與IL-23共培養(yǎng)后,IL-23可誘導(dǎo)PBMCs產(chǎn)生IL-6及IL-17,當(dāng)加入12.5ug/ml紫草素可抑制IL-23誘導(dǎo)IL-6及IL-17的產(chǎn)生。12.5ug/ml紫草素、IL-23與PBMCs共培養(yǎng)后,細(xì)胞存活率無明顯下降。<

14、br>　　 (七)環(huán)孢素A(CsA)抑制IL-23誘導(dǎo)銀屑病患者PBMCs產(chǎn)生IL-6、IL-17及對(duì)細(xì)胞存活率的影響
　　 PBMCs與IL-23共培養(yǎng)后,IL-23可誘導(dǎo)PBMCs產(chǎn)生IL-6及IL-17,加入30ug/ml環(huán)孢素可抑制IL-23誘導(dǎo)IL-6及IL-17的產(chǎn)生。與medium相比,30ug/ml環(huán)孢素、IL-23與PBMCs共培養(yǎng)后,細(xì)胞存活率無明顯下降。
　　 結(jié)論
　　 紫草素能抑制IL