內(nèi)毒素血癥過程中組蛋白的甲基化修飾及其對炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)感染時，細菌的細胞壁成份-內(nèi)毒素(endotoxin)，或稱為脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)被釋放入血。釋放入血的LPS能廣泛作用于免疫細胞產(chǎn)生大量的細胞因子，如腫瘤壞死因子α(TNFα)、白介素6(IL-6)、白介素1(IL-1)、干擾素(INF)、一氧化氮(NO)、血小板活化因子等，即“細胞因子風暴(cytokine storm)”，進而引起失控性炎

2、癥級聯(lián)反應(yīng)，最終引起內(nèi)毒素休克、組織損傷，嚴重時可發(fā)展為多器官功能障礙(mutiple organ dysfunction)。目前，對于內(nèi)毒素血癥的治療方案主要有抗生素、抗內(nèi)毒素抗體、炎性介質(zhì)拮抗劑、傳統(tǒng)中醫(yī)藥以及血液凈化等，但均有不足，如療效并不顯著，或副作用比較大。因此，探索和認識內(nèi)毒素血癥的確切發(fā)病機制和干預(yù)措施，對防治內(nèi)毒素休克及MODS具有重要的理論意義和實用價值。
　　 LPS通過TLR4及其介導的信號通路激活細胞，

3、誘導多種細胞因子的表達。在這些表達產(chǎn)物中，不僅有促炎細胞因子和抗炎細胞因子，還有趨化因子、抗微生物的蛋白、組織修復因子、代謝調(diào)控因子和獲得性免疫的調(diào)控因子。這些產(chǎn)物的功能不同，對組織損傷及內(nèi)環(huán)境的影響也有不同。例如，促炎細胞因子和抗微生物的蛋白對保護性免疫反應(yīng)來說非常關(guān)鍵，但是，如前所述，持續(xù)或過度產(chǎn)生的促炎癥細胞因子可導致全身炎癥反應(yīng)及休克，而過度產(chǎn)生的抵抗微生物的蛋白對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性影響非常小。所以，為了免受致病菌的感染，在炎癥反應(yīng)過

4、程中需要對基因的表達進行精細的調(diào)控，既要控制促炎細胞因子的過度產(chǎn)生，以避免對組織的損傷;又要持續(xù)不斷地產(chǎn)生抗微生物的蛋白，防止微生物的入侵。
　　 然而，這些具有不同功能的基因都受到同一個受體(TLR4)及其介導信號通路的調(diào)控，并且還發(fā)生在同一種細胞類型（如巨噬細胞）中，因此其調(diào)節(jié)必然要求下游水平的差異調(diào)控，以達到選擇性表達或沉默功能相同基因的目的。這一調(diào)節(jié)不影響受到相同受體誘導的其它基因的激活或抑制，是一種基因特異性的調(diào)控。<

5、br>　　 基因的特異性調(diào)控主要是在組蛋白修飾水平實現(xiàn)的。組蛋白修飾包括多種修飾方式，如賴氨酸甲基化、乙?；z氨酸磷酸化，泛素化，糖基化等。這些修飾參與調(diào)控許多細胞生物學過程，包括基因表達、有絲分裂、細胞分化、X染色體失活以及基因印記等。調(diào)控組蛋白修飾的有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙?；敢约斑@些酶相關(guān)的蛋白復合體等。在這些酶及相關(guān)蛋白復合體的作用下，組蛋白的修飾發(fā)生改變，并可影響高度有序的染色質(zhì)

6、結(jié)構(gòu)和參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這一調(diào)節(jié)主要體現(xiàn)在:①通過乙?；?去乙?；淖兘M蛋白N端的電荷從而改變組蛋白和DNA的緊密程度;②形成一處有高親和力的位點，這一位點可以募集到具有局部重構(gòu)染色質(zhì)作用的非組蛋白效應(yīng)蛋白及復合體。
　　 對內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance)機制的深入研究證實了基因特異性調(diào)控這一觀點。內(nèi)毒素耐受是指動物或體外培養(yǎng)的巨噬細胞/單核細胞在給予LPS預(yù)處理后，再次給予LPS刺激時對LPS的反應(yīng)降低，在動

7、物模型中表現(xiàn)為動物死亡率降低，細胞因子如TNFα、IL-6和IL-1的釋放減少，但是與抗菌能力相關(guān)的分子如內(nèi)生性致熱原增加等;而離體巨噬/單核細胞則表現(xiàn)為LPS引起的補體受體3(complement receptor type3)和FcⅢ/Ⅱ受體表達上調(diào)，Cnlp(cathelicidin-related antimicrobial peptide)表達亦增加。由于這兩類基因的誘導表達均依賴TLR及其介導的信號通路，因此推測它們的表達是

8、受基因特異(gene-specific)而不是信號通路特異(signal-specific)機制的調(diào)控。
　　 為了弄清調(diào)控這兩類功能不同基因的特異性機制，F(xiàn)oster等人按照功能和調(diào)節(jié)需要，將TLR誘導的基因分為兩類。第一類基因，耐受性(tolerizable)基因，在耐受的巨噬細胞受到LPS刺激時不能被再次誘導;第二類基因，非耐受性(non-toleriza ble)基因，在耐受的巨噬細胞中仍然可以被誘導。研究發(fā)現(xiàn)，耐受性基

9、因包括了多種炎癥介質(zhì)，而非耐受性基因包含了抗微生物因子、病原體識別受體、趨化因子和非直接引起組織損傷的其它基因。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這兩類基因的誘導表達需要不同的組蛋白修飾模式。正常巨噬細胞受到LPS刺激時，上述兩類基因啟動子區(qū)的組蛋白4(H4)均發(fā)生了乙酰化，但是只有非耐受性的基因在受到LPS的再次刺激后其啟動子部位的H4再次發(fā)生了乙?；?。在內(nèi)毒素耐受的巨噬細胞，非耐受性基因啟動子部位組蛋白乙?；降膭討B(tài)變化反映了基因表達水平的變化:即

10、耐受的細胞在受到再次刺激前，與正常細胞相比其非耐受性基因啟動子處組蛋白乙酰化的水平保持在相對較高的水平;受到刺激后乙?；竭M一步升高，甚至升得更快和更高。因此，可耐受性基因和不可耐受性基因其組蛋白的乙酰化狀態(tài)直接與它們的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)。上述結(jié)果表明炎癥細胞是可以通過組蛋白修飾調(diào)控特定基因的表達狀態(tài)，如激活還是沉默。
　　 對基因特異性調(diào)控的認識，使我們開始反思現(xiàn)有一些抗炎藥物治療效果不佳或者副作用過大的原因。由于過度或持續(xù)炎癥反

11、應(yīng)對組織造成的損害主要由炎癥介質(zhì)的過度釋放引起，而炎癥介質(zhì)的過度釋放與相關(guān)信號通路激活有關(guān)，因此人們一直把注意力放在如何有效調(diào)控信號通路上，即試圖通過抑制信號通路控制炎癥介質(zhì)的過度產(chǎn)生，其結(jié)果是同時抑制了抗微生物多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，使病人對感染的易感性增加，并且由于對其他保護反應(yīng)如代謝和組織修復等的抑制而產(chǎn)生了很大的副作用。所以，探討組蛋白修飾在基因特異性調(diào)控中的作用，不僅有助于闡明內(nèi)毒素休克及炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)病機制，而且為今后尋求更

12、為有效、合理的抗炎藥物具有積極的指導作用。
　　 基于上述認識，本實驗室前期利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析了小鼠內(nèi)毒素休克后肝臟組織的核蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個組蛋白成員的等電點發(fā)生了顯著酸化，這些變化多數(shù)發(fā)生在LPS刺激后的30 min和3h時間點。組蛋白等電點的酸化主要與組蛋白的翻譯后修飾有關(guān)，這些修飾主要包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等，經(jīng)過修飾的組蛋白可改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，進而對其下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

13、>　　 因此，本實驗的主要目的是研究在內(nèi)毒素血癥中有哪些組蛋白修飾受到影響，探索調(diào)控炎癥因子轉(zhuǎn)錄的組蛋白修飾。據(jù)此，本實驗分為兩個部分:
　　 第一部分:檢測LPS刺激巨噬細胞后組蛋白H3的K4、K9、K27、K36、K79，組蛋白H4的K20位點處甲基化以及H3、H4泛乙?；淖兓闆r。
　　 第二部分:探討在第一部分實驗中變化較明顯的修飾是否參與了炎癥因子IL-6和TNFα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 實驗結(jié)果如下:

14、
　　 1.Western Blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用LPS(100μg/L)刺激巨噬細胞（RAW264.7細胞和BMM細胞）0.5 h、1h、2h、3h、6h后，與未刺激對照組(0 h)相比，H3K4me2/3、H3K9me2/3、H3K27me2、H3K36me2、H3K79me2、H4K20me3、H3乙?；?、H4乙?；加胁煌潭鹊脑鰪?，其中，H3K4me2/3和H3K9me2/3增強明顯;H3K4me1、H3K9泛甲基化

15、、H4K20me1/2無明顯變化。
　　 2.由于H3K4me2和H3K9me2在LPS刺激巨噬細胞后0.5 h明顯增強，故選擇這兩種修飾位點進行下一步實驗。分別用H3K4me2和H3K9me2的抗體富集與H3K4me2和H3K9me2位點結(jié)合的DNA(ChlP實驗)，用熒光定量PCR實驗檢測與H3K4me2和H3K9me2位點結(jié)合的IL-6和TNFα基因啟動子的情況。結(jié)果顯示，LPS(100μg/L)刺激RAW264.7細胞0

16、.5 h后，H3K4me2與IL-6和TNFα基因啟動子結(jié)合增強，分別是對照組的121.8、5.46倍;H3K9me2與IL-6和TNFα基因啟動子的結(jié)合沒有增強。
　　 3.為了進一步明確H3K4me2修飾是否參與了IL-6和TNFα的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，本實驗用組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 MTA(5'-Deoxy-tp-(methylthio)adenosine)抑制H3K4me2/3的修飾然后檢測其對IL-6和TNFα mRNA水平

17、有無影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用MTA(0.25mmol/L、0.5mmol/L、1 mmol/L)預(yù)處理RAW264.7細胞后，細胞免疫熒光實驗和Western Blot均顯示H3K4me2/3修飾受到抑制;進一步用熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，當H3K4me2/3被抑制后IL-6和TNFα的mRNA水平降低，其中，當MTA預(yù)處理濃度為0.5mmol/L時，與單獨LPS刺激后相比，IL-6的mRNA水平降低了47％，TNFα的mRNA水平降低了48％

18、;當MTA預(yù)處理濃度為1 mmol/L時，IL-6的mRNA水平降低了90％，TNFα的mRNA水平降低了78％。IL-6和TNFα mRNA水平的改變具有MTA濃度依賴性。
　　 根據(jù)以上結(jié)果，得到以下初步結(jié)論:
　　 1.在內(nèi)毒素血癥的發(fā)生發(fā)展過程中，H3K4me2/3、H3K9me2/3、H3K27me2、H3K36me2、H3K79me2、H4乙酰化發(fā)生了改變，且隨著時間的變化而動態(tài)變化。H3K4me2和H3K9