鋅指蛋白HZF1基因功能和機(jī)制研究.pdf

1、人體內(nèi)血細(xì)胞的生產(chǎn)是由骨髓中的造血干細(xì)胞(Hematopoietic Stem Cells，HSCs)負(fù)責(zé)的。造血干細(xì)胞相繼定向到不同鏈系祖細(xì)胞，再進(jìn)一步成為更為限制的鏈系前體細(xì)胞并進(jìn)而繼續(xù)分化發(fā)育成不同類型血細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、巨核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等)。這些過(guò)程受到轉(zhuǎn)錄因子和造血生長(zhǎng)因子的調(diào)控。這些轉(zhuǎn)錄因子有一部分是鋅指蛋白。它們?cè)谠煅l(fā)育的各個(gè)過(guò)程中扮演著重要角色，構(gòu)成了造血過(guò)程中細(xì)胞分化的內(nèi)在基因表達(dá)程序的重要部分。
　　

2、 2000年，本實(shí)驗(yàn)室從人骨髓cDNA文庫(kù)中篩選到一個(gè)新的編碼鋅指蛋白的cDNA序列,命名為HZF1。HZF1編碼670個(gè)氨基酸殘基，其中包含連續(xù)的15個(gè)C2H2型和2個(gè)C2R2型鋅指模體。HZF1mRNA在人各個(gè)器官中均有表達(dá)，在各種造血細(xì)胞系中也都有表達(dá)。反義RNA和RNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明，HZF1內(nèi)源表達(dá)被阻遏時(shí)，hemin誘導(dǎo)的K562紅系分化被抑制，PMA誘導(dǎo)的巨核系分化明顯減弱。這表明鋅指蛋白HZF1在K562細(xì)胞紅系分化

3、和巨核系分化過(guò)程中具有重要作用。本論文在實(shí)驗(yàn)室已有的研究基礎(chǔ)上，利用酵母雙雜交系統(tǒng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶檢測(cè)和基因芯片技術(shù)對(duì)HZF1基因的功能和機(jī)制做了進(jìn)一步研究。
　　 為了尋找在HZF1行使功能過(guò)程中與其相互作用的蛋白質(zhì)，我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以HZF1基因的片段(H2)為誘餌蛋白，從人骨髓cDNA文庫(kù)中篩選與HZF1相互作用的蛋白。從1478個(gè)克隆中初步鑒定出了288個(gè)陽(yáng)性克隆，進(jìn)行表型檢測(cè)排除了59個(gè)假陽(yáng)性；對(duì)剩下的229個(gè)陽(yáng)

4、性克隆進(jìn)行分類后，進(jìn)行序列測(cè)定，再利用NCBI網(wǎng)站上的在線軟件BLAST對(duì)這些cDNA序列進(jìn)行分析，排除非編碼序列，排除編碼框不正確的序列，對(duì)重復(fù)的序列進(jìn)行歸類，最后找到了30個(gè)編碼正確的cDNA序列，這些序列編碼的蛋白可能與HZF1發(fā)生相互作用。這些蛋白包括細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、真核轉(zhuǎn)錄延伸因子、核糖體蛋白、細(xì)胞分化相關(guān)蛋白、免疫相關(guān)蛋白和肌肉分化相關(guān)蛋白等，還包括兩個(gè)假想蛋白。隨后，我們進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，排除了2個(gè)自激活的假陽(yáng)性克隆。經(jīng)

5、過(guò)進(jìn)一步的分析和比較，我們選擇8-23、15-83和11-20這三個(gè)陽(yáng)性克隆作為深入研究的對(duì)象。8-23是INCA1(inhibitor of CDK interacting with cyclin A1)基因一個(gè)剪接體的編碼區(qū)的一部分，15-83是FHLl(four and a half LIM domainsl)基因編碼區(qū)的一部分，11-20是ZNF7(zinc finger protein7)基因編碼區(qū)的一部分。我們利用PCR方法

6、克隆得到了FHL1的全長(zhǎng)cDNA序列。
　　 隨后，用免疫共沉淀的方法進(jìn)一步確認(rèn)相互作用的存在。首先構(gòu)建HZF1基因片段H2與FLAG標(biāo)簽的融合表達(dá)質(zhì)粒以及FHL1、INCA1片段和ZNF7片段與myc標(biāo)簽的融合表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)而將H2-FLAG融合表達(dá)質(zhì)粒分別與FHL1-myc、INCA1-myc和ZNF7-myc融合表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞，用小鼠源anti-FLAG單克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，最后

7、利用小鼠源單克隆抗體anti-FLAG和anti-myc進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)。WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HZF1可分別與FHL1和INCA1發(fā)生相互作用，但是不能和ZNF7發(fā)生相互作用。
　　 用Real-timePCR檢測(cè)了INCA1在hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化過(guò)程中的表達(dá)變化情況。用hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化，在0、12、24和48h收集細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行Real-tim

8、ePCR檢測(cè)。結(jié)果表明，INCA1在K562紅系誘導(dǎo)分化過(guò)程中表達(dá)水平上升，24小時(shí)達(dá)到最高，與HZF1的變化趨勢(shì)一致。這表明HZF1和INCA1可能在紅系分化過(guò)程中協(xié)同發(fā)揮作用。
　　 為了分析K562細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中HZF1表達(dá)阻遏前后ERK信號(hào)通路的變化，我們檢測(cè)了細(xì)胞中ERK和MEK磷酸化水平的變化。用HZF1內(nèi)源表達(dá)被RNAi抑制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株K562/pAVu6HZFli和對(duì)照細(xì)胞K562/pAVu6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)

9、現(xiàn)在未使用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的情況下K562/pAVu6HZFli細(xì)胞中ERK和MEK的磷酸化水平要高于對(duì)照細(xì)胞K562/pAVu6。在誘導(dǎo)過(guò)程中，K562/pAVu6HZFli細(xì)胞中ERK和MEK的磷酸化水平也比對(duì)照細(xì)胞K562/pAVu6要高，但變化趨勢(shì)與對(duì)照細(xì)胞基本一致。這說(shuō)明HZF1可能通過(guò)調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路參與紅系和巨核系分化的調(diào)節(jié)。
　　 為了獲得HZF1功能機(jī)制的更多線索，我們利用基因芯片檢測(cè)了RNA干擾抑制HZF1表達(dá)前

10、后K562細(xì)胞的基因表達(dá)差異。使用Affymetrix的在線分析中心(The Net Affyr MAnalysis Center，www.affymetrix.com)對(duì)結(jié)果進(jìn)行了分析，并對(duì)表達(dá)升高或降低的基因根據(jù)功能進(jìn)行了分類，發(fā)現(xiàn)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期相關(guān)的基因占了很大比例。
　　 綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)了HZF1與INCA1(cyclinAl-CDK復(fù)合物的一個(gè)抑制因子)的相互作用。同時(shí)，我們也