STK1基因的功能研究.pdf

1、由玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）引起的玉米大斑病是威脅玉米生產(chǎn)安全的重要病害之一，常造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，許多植物病原真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育及致病性都受到細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，其中MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是普遍存在的并有重要調(diào)控作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。玉米大斑病菌中的STK1基因是編碼MAPK 信號(hào)途徑中MAPkinase 一個(gè)基因，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)該基因與大斑病菌的致病性和分生孢子萌發(fā)有關(guān)，但該基因參與玉米大

2、斑病菌滲透調(diào)節(jié)的具體作用尚不明確。本試驗(yàn)在克隆STK1基因的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)它與其他真菌的滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的MAPkinase基因具有很高的同源性。為了進(jìn)一步明確該基因的功能，本實(shí)驗(yàn)采用功能互補(bǔ)的方法，構(gòu)建了釀酒酵母胞內(nèi)表達(dá)載體，使該基因在釀酒酵母HOG1基因缺失突變體中表達(dá)，以進(jìn)一步明確STK1基因的功能。主要結(jié)果如下：
　　 1.獲得了STK1基因全長(zhǎng)序列，并最終確定一個(gè)全長(zhǎng)為1071 bp的開放閱讀框（

3、OpenReading Frame，ORF）。對(duì)STK1基因的開放閱讀框進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，利用相關(guān)軟件對(duì)該基因進(jìn)行翻譯，發(fā)現(xiàn)該基因編碼356個(gè)氨基酸的蛋白。經(jīng)對(duì)該基因的預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)蛋白與許多植物病原真菌滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的MAP kinase 都有90％以上的同源性；通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白與這些真菌中MAP kinase 相似，含有滲透脅迫相關(guān)的MAP kinase 所具有的保守結(jié)構(gòu)域：TGY motif、CD doma

4、in、BD domain。其中，171～173位的TGY motif是滲透相關(guān)的MAP kinase的典型特征，CD domain和BDdomain是MAP kinase上游調(diào)節(jié)物和下游效應(yīng)物的結(jié)合和催化部位；聚類分析將不同的MAP kinase分為3個(gè)不同的類群，即Hog1、Fus3/Kss1和Slt2，其中Stk1 與Hog1 類群聚類在一起。
　　 2.構(gòu)建了釀酒酵母表達(dá)載體pVT102U-STK1，進(jìn)而以該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀

5、酒酵母HOG1基因缺失突變體，通過釀酒酵母相關(guān)的氨基酸合成缺陷篩選及PCR 驗(yàn)證獲得了陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
　　 3.對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了多種脅迫處理，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下該基因能夠恢復(fù)釀酒酵母HOG1 缺失突變體對(duì)鹽的敏感性，并能恢復(fù)其異常的的細(xì)胞形態(tài)至正常的表型。并能恢復(fù)HOG1 缺失突變體對(duì)氧脅迫的敏感性，說明STK1基因具有抵抗氧脅迫的的作用。
　　 4.研究發(fā)現(xiàn)，STK1基因不僅能夠抵抗各種鹽脅迫，其轉(zhuǎn)化子在鈉鹽脅迫下的生長(zhǎng)