4-氨基-1-萘酚類ABL和AKT1蛋白激酶抑制劑的設計、合成和初步活性研究.pdf

1、目的:異常的血管生成，包括內(nèi)皮細胞激活、降解基底膜、內(nèi)皮細胞的定向運動和增殖、新生微血管、內(nèi)皮細胞新的基底膜合成、血管腔產(chǎn)生、芽式生長并形成血管襟等一系列步驟，是腫瘤細胞增殖，侵襲和轉移的先決條件。Abl和Akt(proteinkinaseB，PKB)蛋白激酶是腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞內(nèi)兩個重要的信號通路節(jié)點，他們可以通過磷酸化下游底物來調節(jié)腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞內(nèi)許多重要的生理過程，包括細胞存活、增殖、遷移和血管生成等。
　　蛋白激酶

2、抑制劑根據(jù)作用于激酶結合位點的不同分為三種:作用于ATP結合位點的蛋白激酶抑制劑，作用于調節(jié)區(qū)的蛋白激酶抑制劑和蛋白激酶底物競爭性變構抑制劑。近幾年，多種靶向于蛋白激酶的藥物如Sunitinib、Sorafenib、Pazopanib等被成功推向了市場用于各種腫瘤的治療。盡管這些腫瘤血管生成抑制劑有著很大的優(yōu)勢，但是實際應用仍存在部分腫瘤對血管的新生依賴性不強、突變及腫瘤信號傳導的代償性導致的耐藥、不良反應和毒性等問題。因此進一步開發(fā)選

3、擇性更強、活性更高且毒性更小的小分子蛋白激酶抑制劑仍然非常必要。隨著對Bcr-Abl和Akt相關信號通路研究的不斷深入，Bcr-Abl和/或Akt抑制劑的研究已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的熱點。
　　方法:本研究首先在計算機虛擬篩選的過程中發(fā)現(xiàn)了具有明顯抗血管生成作用的化合物Hit6a。后期的酶譜篩選工作表明，6a可以選擇性的抑制Abl和Akt1兩個激酶，靶點非常明確。之后我們設計合成了五個系列基于4-氨基-1-萘酚骨架的6a類似物，并

4、進行了體外抗腫瘤細胞增殖、抗血管生成和蛋白激酶抑制活性研究，一方面對這一類結構骨架化合物進行構效關系(SAR)研究，另一方面也希望獲得比Hit6a的抗腫瘤和抗血管生成活性更好的先導結構。
　　結果:本研究共設計、合成了五個系列81個基于4-氨基-1-萘酚骨架的Hit6a類似物，并對所合成的目標化合物通過電噴霧質譜以及核磁共振氫譜等方法進行了結構確證，經(jīng)查閱文獻證實，除個別化合物外所合成的目標化合物均為新型化合物，未見文獻報道。我們

5、對合成的化合物進行了體外抗腫瘤細胞增殖活性、體外抗血管生成活性和抑酶活性研究。實驗結果表明，合成的4-氨基-1-萘酚類化合物在抑酶活性研究中表現(xiàn)出的構效關系規(guī)律與在體外抗腫瘤細胞增殖和體外抗血管生成活性研究中表現(xiàn)出的構效關系規(guī)律具有高度的一致性，而且化合物的抗血管生成活性與抑制VEGF/VEGFR無關，這給我們這樣的提示，即合成的4-氨基-1-萘酚類化合物是通過抑制Abl和Akt1蛋白激酶的活性來實現(xiàn)其抗腫瘤細胞增殖和抗血管生成活性的。

6、
　　構效關系研究表明，Hit6a的萘酚環(huán)（Figure5-1，a部分）可以通過疏水作用或者π-π堆積作用與激酶活性位點的疏水性口袋的結合，將萘環(huán)變?yōu)檩^小的苯環(huán)后（D系列）會導致化合物與受體的結合力下降，抑酶活性和抗血管活性明顯下降，抗腫瘤細胞增殖活性幾乎喪失;而在萘環(huán)的6，7位引入兩個甲氧基基團后（E系列），將增強化合物的疏水性，增強與受體結合能力，進而化合物的抑酶活性、抗血管活性和抗腫瘤細胞增殖活性明顯增強。而在7位保持甲氧基

7、不變，6位引入丙基嗎啉側鏈(33a)時，一方面提高了化合物水溶性，另一方面通過氫鍵作用增強了化合物與受體的結合力，使化合物能夠充分的占據(jù)結合口袋的空腔區(qū)域，提高了化合物的抑酶活性，抗血管活性和抗腫瘤細胞增殖活性。
　　Hit6a的三氮唑五元芳雜環(huán)（Figure5-1，b部分）可以伸向Abl和Akt1激酶的DFGmotif，并與DGFin構象（蛋白處于活化狀態(tài)時的構象）的氨基酸ASP形成氫鍵作用;當其被5-甲基-1，3，4-噻二唑、

8、1，3，4-噻二唑或者1-甲基-四氮唑環(huán)替代后氫鍵作用消失，同時引起化合物分子在受體結合口袋中結合位置和構象的改變，導致抑酶活性急劇降低，抗血管活性和抗腫瘤細胞增殖活性大大減弱;而當三氮唑五元芳雜環(huán)被嘌呤環(huán)替換（B系列）后，引起化合物分子在受體結合口袋中結合位置和構象的改變，但是嘌呤環(huán)可以與結合口袋中的其他位置氨基酸形成氫鍵作用，最終抑酶活性稍有降低，抗血管活性和抗腫瘤細胞增殖活性稍有減弱。需要注意的是三氮唑五元雜環(huán)被嘌呤環(huán)替換后，化合

9、物（比如9n）對激酶選擇的特異性會下降，而這并不是我們所期望的。
　　Hit6a的磺酰胺基-SO2NH-（Figure5-1，c部分）可以與Abl和Akt1激酶活性口袋內(nèi)鉸鏈區(qū)、G-loop或者P-loop區(qū)域氨基酸殘基形成氫鍵作用，提高化合物與激酶的結合力，同時該基團可以使化合物保持在一個易于與活性口袋結合的構象;而用-CONH-基團替代后，氫鍵作用消失，化合物的空間構象也不利于與活性口袋結合（比較Figure4-1中的9d和1

10、3q），導致抑酶活性大大降低甚至消失，抗血管活性和抗腫瘤細胞增殖活性大大減弱。
　　Hit6a的R位置2-萘基（Figure5-1，d部分）可以與Abl和Akt1激酶活性口袋內(nèi)鉸鏈區(qū)，該位置不同的芳香基(R)基團對化合物的激酶抑制活性的影響呈現(xiàn)出了一定的規(guī)律性。(a)R基團為苯基時要比為較大的基團（如萘基，喹啉基，4-叔丁基苯基和4-(1，1'-聯(lián)苯)基）或者較長（苯乙烯基）的基團時活性好(13a和13bvs13c和13d，9f和

11、9pvs9a和9g)。(b)R基團為苯基時，苯環(huán)上連接吸電子基團（13d/13c的-NO2/-Cl）的化合物要比連接推電子基團的的化合物（13e/13i的-OMe/-Me）活性好。(c)R基團上為雙取代基時化合物的抑制活性要比單取代時的抑制活性要好(9e，9k,9nvs9j，9d，9b)。
　　基于以上構效關系研究結果，在E系列抑制劑設計中，我們保存了化合物中間骨架萘酚環(huán)，磺酰胺基團和三氮唑五元雜環(huán)，同時在萘環(huán)的6，7位引入兩個甲

12、氧基基團，甲氧基的引入能夠進一步增強萘酚片段的疏水作用，從而提高對Abl和Akt1激酶的抑制活性，提高其選擇性。該系列化合物26a-26g的體外抑酶活性明顯好于前四個系列，整體IC50值在1μM以下，其中活性最好的化合物26g對Abl和Akt1激酶的IC50值分別為0.16和0.46μM，比Hit6a的抑酶活性要高約10倍;但甲氧基的引入導致化合物的水溶性較差，我們在對26g進行水溶性改善時設計合成了6位氧上含有丙基嗎啉側鏈的化合物33

13、a，活性測試結果顯示33a對Abl和Akt1激酶的IC50值分別為0.13和0.28μM。丙基嗎啉側鏈的引入既能提高化合物26g的水溶性，又能使化合物的抑酶活性得到保持，所以化合物33a是一個非常有前景的具有良好水溶性和抗腫瘤活性的Abl和Akt1雙靶點抑制劑。
　　結論:本研究基于Abl和Akt1晶體結構及Hit6a與活性位點的結合模式，在實驗室前期工作基礎上，設計、合成了五個系列共81個基于4-氨基-1-萘酚骨架的Hit6a類

14、似物。通過初步的體外生物活性評價，我們發(fā)現(xiàn)了幾個具有進一步研究開發(fā)價值的化合物，如:化合物26g和33a等，并進一步對其進行了以分子對接為主的構效關系研究，探討了其與Abl和Akt1靶點的結合模式，為今后新型小分子Abl和Akt1抑制劑的設計、合成奠定了基礎。
　　直接以內(nèi)皮細胞為研究靶標，在對血管內(nèi)皮細胞增殖與抑制的相關分子的深入了解基礎上，采用相應的藥物阻斷其胞內(nèi)信號傳導通路中的關鍵蛋白Abl和Akt，抑制血管內(nèi)皮細胞增殖及腫