PcrV被動(dòng)及主動(dòng)免疫在多重耐藥銅綠假單胞菌致肺損傷保護(hù)作用研究.pdf

1、第一部分:PcrV被動(dòng)免疫在多重耐藥銅綠假單胞致細(xì)胞毒性的保護(hù)作用研究
　　目的:通過(guò)測(cè)定臨床分離的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢ secretion system，T3SS)表達(dá)情況，比較耐藥組和敏感組菌株T3SS表達(dá)有無(wú)差異，應(yīng)用PcrV抗體，觀察PcrV被動(dòng)免疫對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌致細(xì)胞毒性是否有保護(hù)作用。
　　方法:隨機(jī)分離保存臨床分離的銅綠假單胞菌株，

2、經(jīng)過(guò)隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分析確認(rèn)為非同一克隆菌株，用微量肉湯稀釋法測(cè)定菌株對(duì)臨床常用抗假單胞菌抗生素的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）將菌株分為多重耐藥組和敏感組。應(yīng)用普通PCR和多重PCR擴(kuò)增T3SS的pcrV基因和毒素基因(exoU，exoS，exoY,exoT)，比較T3SS的基因型在耐藥組和敏

3、感組之間有無(wú)差異。Real-time PCR測(cè)定pcrV的相對(duì)表達(dá)水平，Western blot測(cè)定ExoU和ExoS的表達(dá)，從而比較T3SS的表型在耐藥組和敏感組之間有無(wú)差異。應(yīng)用BEAS-2B細(xì)胞株，銅綠假單胞菌感染后，測(cè)定培養(yǎng)基中的LDH濃度，比較應(yīng)用PcrV抗體后，培養(yǎng)基中的LDH濃度有無(wú)變化，從而觀察PcrV被動(dòng)免疫對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌致細(xì)胞毒性有無(wú)保護(hù)作用。
　　結(jié)果:共分離出53株非同一克隆的臨床菌株，包括25個(gè)多

4、重耐藥菌株和28株敏感菌株，pcrV, exoT，exoY幾乎在所有菌株中均為陽(yáng)性，exoU陽(yáng)性率在30％左右，exoS陽(yáng)性率在70％左右，兩組之間無(wú)顯著性差異;Real-time PCR比較之間pcrV相對(duì)表達(dá)無(wú)明顯差異，Western blot比較兩組之間ExoU，ExoS無(wú)顯著性差異。銅綠假單胞菌感染后，培養(yǎng)基中LDH顯著升高，應(yīng)用PcrV抗體后，LDH濃度有顯著下降，下降20％左右，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性（P＜0.05）。

5、>　　結(jié)論:銅綠假單胞菌的T3SS的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，在耐藥組和敏感組之間無(wú)明顯差異，PcrV被動(dòng)免疫后，細(xì)菌的毒力下降，對(duì)多重耐藥菌株致細(xì)胞毒性具有顯著保護(hù)作用，在銅綠假單胞菌日益顯著的耐藥問(wèn)題上，T3SS可以作為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)，有望解決日益嚴(yán)重的銅綠假單胞菌耐藥問(wèn)題。
　　第二部分: PcrV被動(dòng)及主動(dòng)免疫在多重耐藥銅綠假單胞菌致肺損傷的保護(hù)作用
　　目的:選擇一株多重耐藥銅綠假單胞菌株，體外分泌ExoU蛋白，建立多重耐藥

6、銅綠假單胞菌感染的小鼠肺損傷模型，觀察PcrV被動(dòng)及主動(dòng)免疫對(duì)小鼠的生存與肺損傷是否具有保護(hù)作用。
　　方法:選擇第一部分中的R4菌株建立小鼠肺損傷模型，通過(guò)氣道內(nèi)滴入法（5×10^6 cfu菌株）制作小鼠肺損傷模型。實(shí)驗(yàn)分組:被動(dòng)免疫組，主動(dòng)免疫組，抗生素治療組，對(duì)照組。在感染后前12小時(shí)，每小時(shí)記錄一次體溫，以后每24小時(shí)記錄一次體溫，觀察7天，觀察小鼠的生存率。另外，分別在感染后的6小時(shí)和12小時(shí)處死小鼠，檢測(cè)血液及肺組織細(xì)

7、菌計(jì)數(shù);檢測(cè)肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)和蛋白濃度;檢測(cè)濕干重比值(W/D)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性;檢測(cè)MIP-2、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子含量;觀察肺組織病理。另外我們進(jìn)一步檢測(cè)分離出細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)和生物膜表達(dá)情況，觀察阻斷PcrV后是否會(huì)影響細(xì)菌的MIC和生物膜的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:在R4感染后，對(duì)照組小鼠在7天內(nèi)死亡率為100％，應(yīng)用頭孢他啶（500mg/kg q12h腹腔注射）后，小鼠

8、的生存時(shí)間得到一定的延長(zhǎng)，但也均于7天內(nèi)死亡。應(yīng)用PcrV抗體（與細(xì)菌預(yù)混后同時(shí)打入小鼠肺內(nèi)），小鼠的生存率得到顯著改善。另外PcrV被動(dòng)免疫后，小鼠血中和肺內(nèi)的細(xì)菌計(jì)數(shù)較其他兩組有顯著降低，肺部炎癥顯著減輕，W/D降低，肺泡灌洗液中蛋白濃度降低，肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，且小鼠肺MPO活性在早期有顯著增加，12小時(shí)后與其他兩組相近。與此同時(shí)，PcrV被動(dòng)免疫后，小鼠血清內(nèi)MIP-2，IL-6，TNF-α水平降低，肺泡灌洗液中IL

9、-6水平與其他兩組相似，MIP-2降低，TNF-α早期升高，12小時(shí)后降低。PcrV主動(dòng)免疫4周后，小鼠血清中PcrV抗體滴度在15-20μg/mL左右，此后感染R4，小鼠的生存率得到顯著改善。另外，阻斷PcrV后，細(xì)菌對(duì)頭孢他啶的MIC沒(méi)有變化，但是可以抑制細(xì)菌生物膜的表達(dá)。
　　結(jié)論:PcrV被動(dòng)免疫后，多重耐藥銅綠假單胞菌感染小鼠的生存率得到顯著改善，同時(shí)小鼠的肺損傷得到顯著減輕。PcrV主動(dòng)免疫四周后，小鼠體內(nèi)血清抗體滴度

10、達(dá)到高峰，多重耐藥菌株感染后小鼠的生存率得到顯著改善。PcrV被動(dòng)及主動(dòng)免疫在多重耐藥銅綠假單胞菌株感染中發(fā)揮保護(hù)作用。并且阻斷PcrV可以抑制細(xì)菌生物膜的形成，使細(xì)菌更易被清除。
　　第三部分:角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2在銅綠假單胞菌致肺損傷的作用研究
　　目的:探討角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（keratinocyte growth factor-2，KGF-2）對(duì)銅綠假單胞菌致肺損傷的保護(hù)作用，及其對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。

11、　　方法:健康雄性Balb/c小鼠25g左右，分成3組，分組如下:1）無(wú)預(yù)處理組:無(wú)預(yù)處理，氣道內(nèi)滴入PBS60μl作為對(duì)照;2）對(duì)照組(control，C):氣道內(nèi)滴入銅綠假單胞菌(PAO1，1×10^7 cfu);3)KGF-2預(yù)處理組:動(dòng)物在感染前72小時(shí)氣道內(nèi)滴入KGF-25mg/kg之后在制作感染模型。在PAO1感染后，前12小時(shí)，每小時(shí)記錄一次體溫，以后每24小時(shí)記錄一次體溫，觀察7天，觀察小鼠的生存率。另外，分別在感染后的

12、6小時(shí)和12小時(shí)處死小鼠，取肺泡灌洗液，血漿，并留取肺組織。血液及肺組織細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè);分類計(jì)數(shù)肺泡灌洗液(BALF)中的細(xì)胞，檢測(cè)BALF中的蛋白濃度。檢測(cè)MIP-2、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子含量;觀察肺組織病理。檢測(cè)KGF-2預(yù)處理對(duì)肺組織p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路活性的影響。體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）進(jìn)一步探討KGF-2對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。
　　結(jié)果:在PAO1感染后，對(duì)照組小鼠在7天內(nèi)死亡

13、率為90％左右，KGF-2預(yù)處理后，小鼠的生存率得到顯著改善。另外KGF-2預(yù)處理后，小鼠血中和肺內(nèi)的細(xì)菌計(jì)數(shù)較對(duì)照組有顯著降低，肺部炎癥顯著減輕，W/D降低，BALF中蛋白濃度降低，肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加。于此同時(shí)，KGF-2預(yù)處理后，小鼠血清內(nèi)MIP-2，IL-6，TNF-α水平降低，肺泡灌洗液中也有所下降。KGF-2預(yù)處理顯著抑制了p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路的活化。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KGF-2增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能。<