青蒿琥酯、氧化苦參堿影響L929和Colon26細(xì)胞培養(yǎng)上清免疫抑制作用的研究.pdf

1、本研究擬用在預(yù)實(shí)驗(yàn)中已篩到的，其培養(yǎng)上清確有免疫抑制作用的兩株腫瘤細(xì)胞，小鼠成纖維母細(xì)胞瘤細(xì)胞株L929和小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株Colon26，作為研究用腫瘤細(xì)胞；選用已報(bào)道有一定抗瘤效應(yīng)，但尚不知是否有逆轉(zhuǎn)腫瘤培養(yǎng)上清免疫抑制作用的兩種中藥提取成分，青蒿琥酯和氧化苦參堿，研究它們是否也具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制性培養(yǎng)上清的作用，為研究中藥抗瘤新機(jī)制和開(kāi)辟篩選抗瘤中藥新途徑進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法：選用L929和Colon2

2、6兩株腫瘤細(xì)胞以及兩種抗腫瘤中藥提取成分青蒿琥酯和氧化苦參堿，分別制備藥物作用一定時(shí)間后洗去藥物，再培養(yǎng)不同時(shí)間的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。其中，青蒿琥酯、氧化苦參堿作用L929細(xì)胞24小時(shí)后洗去藥物，加入新鮮培養(yǎng)液，重新調(diào)整細(xì)胞濃度后，冉培養(yǎng)24小時(shí)(第一次再培養(yǎng))的上清稱為A-L1、O-L1，相應(yīng)的以完全培養(yǎng)液代替藥物同步處理所獲的對(duì)照培養(yǎng)上清稱為control-L1；第一次再培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞以新鮮培養(yǎng)液重新調(diào)整細(xì)胞濃度后，再培養(yǎng)24小時(shí)(第

3、二次再培養(yǎng))的各相應(yīng)的上清分別稱為A-L2、O-L2、control-L2；青蒿琥酯、氧化苦參堿作用Colon26細(xì)胞的各上清制備，除培養(yǎng)時(shí)間改為48小時(shí)外余均同上。第一次再培養(yǎng)所獲的各相應(yīng)上清分別稱為A-C1、O-C1和control-C1，第二次再培養(yǎng)所獲的各相應(yīng)上清分別稱為A-C2、O-C2和control-C2。MTT法檢測(cè)各上清對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化及對(duì)小鼠脾細(xì)胞NK殺傷活性的影響，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析法檢測(cè)各上清對(duì)Con

4、A誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化中CD4+細(xì)胞及CD8+細(xì)胞百分率的影響。 研究結(jié)果： 1.各種L929細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)小鼠脾細(xì)胞免疫功能的影響。 1.1.對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響：與無(wú)腫瘤上清作用的單純脾細(xì)胞ConA轉(zhuǎn)化對(duì)照組相比，control-L1和control-L2可明顯抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化(抑制率分別為48.71±2.88％和53.83±3.42％，均P＜0.01)；與control-L1相

5、比，A-L1、O-L1對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制均明顯降低(抑制率分別為37.50±6.58％和38.11±6.00％，均P＜0.01)；與control-L2相比，A-L2、O-L2對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制均明顯降低(抑制率分別為48.71±3.52％和45.26±10.47％，均P＜0.01)。 1.2.對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化中CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞百分率的影響：與無(wú)腫瘤上清作用的單純脾細(xì)胞

6、ConA轉(zhuǎn)化對(duì)照組CD4+細(xì)胞的百分率(48.24±2.10％)相比，control-L1組和control-L2組中CD4+細(xì)胞的百分率均明顯降低(分別為22.72±2.61％和21.89±2.18％，均P＜0.01)；與control-L1組相比，A-L1組和O-L1組中CD4+細(xì)胞的百分率均明顯升高(分別為28.20±2.66％和25.91±2.03％，均P＜0.05)；與control-L2組相比，A-L2組和O-L2組中CD4

7、+細(xì)胞的百分率均明顯升高(分別為27.69±1.26％和25.68±2.67％，均P＜0.05)。對(duì)CD8+細(xì)胞百分率，A-L1組和O-L1組與control-L1組相比、A-L2組和O-L2組與control-L2組相比，均無(wú)顯著差異(均P＞0.05)。 1.3.對(duì)小鼠脾細(xì)胞NK殺傷活性的影響：與無(wú)腫瘤上清作用的單純脾細(xì)胞殺傷對(duì)照組(殺傷率為65.39±0.87％)相比，control-L1和control-L2均可明顯抑制小

8、鼠脾細(xì)胞NK殺傷活性(殺傷率分別為60.97±3.86％和59.59±3.13％，均P＜0.01)；與control-L1相比，A-L1組和O-L1組NK殺傷率均明顯升高(殺傷率分別為67.58±4.83％，P＜0.01；64.64±7.46％，P＜0.05)；與control-L2相比，A-L2組和O-L2組NK殺傷率均明顯升高(殺傷率分別為66.14±4.10％和68.63±4.10％，均P＜0.01)。 2.各種Colon

9、26細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)小鼠脾細(xì)胞免疫功能的影響。 2.1.對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響：與無(wú)腫瘤上清作用的單純脾細(xì)胞ConA轉(zhuǎn)化對(duì)照組相比，control-C1和control-C2均可明顯抑制ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化(抑制率分別為46.63±7.68％和37.82±6.71％，均P＜0.01)；與control-C1相比，A-C1對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制明顯降低(抑制率為27.83±5.50％，P＜0.05)

10、，而O-C1對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制(抑制率為44.40±9.90％)與control-C1組無(wú)明顯差異(P＞0.05)；與control-C2相比，A-C2對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制明顯降低(抑制率為5.48±7.22％，P＜0.01)，而O-C2對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制(抑制率為46.78±8.17％)與control-C2組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 2.2.對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞轉(zhuǎn)

11、化中CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞百分率的影響：與無(wú)腫瘤上清作用的單純脾細(xì)胞ConA轉(zhuǎn)化對(duì)照組CD4+細(xì)胞的百分率(48.24±2.10％)相比，control-C1組和control-C2組中CD4+細(xì)胞的百分率均明顯降低(分別為31.97±2.71％和33.98±1.53％，均P＜0.01)；與control-C1組相比，A-C1組中CD4+細(xì)胞的百分率均明顯升高(38.68±1.59％，P＜0.05)，而O-C1組中CD4+細(xì)胞的百分

12、率(34.77±3.31％)與control-C1組無(wú)明顯差異(P＞0.05)；與control-C2組相比，A-C2組中CD4+細(xì)胞的百分率明顯升高(40.35±2.59％，P＜0.05)，而O-C2組中CD4+細(xì)胞的百分率(33.53±2.69％)與control-C2組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。A-C1組和O-C1組與control-C1組相比、A-C2組和O-C2組與control-C2組相比，CD8+細(xì)胞百分率均無(wú)顯著差異(

13、均P＞0.05)。 2.3.對(duì)小鼠脾細(xì)胞NK殺傷活性的影響：與無(wú)腫瘤上清作用的單純脾細(xì)胞殺傷對(duì)照組(殺傷率為69.84±7.71％)相比，control-C1和control-C2可明顯抑制小鼠脾細(xì)胞NK殺傷活性(殺傷率分別為49.62±6.77％和52.31±6.56％，P均＜0.01)；與control-C1組相比，A-C1組NK殺傷活性明顯升高(殺傷率為57.21±3.38％，P＜0.05)，而O-C1組(殺傷率45.42

14、±8.98％)無(wú)明顯差異(P＞0.05)；A-C2組和O-C2組NK殺傷率(分別為55.42±5.92％和47.47±9.24％)與control-C2組均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 研究結(jié)論： 1.L929和Colon26腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)小鼠脾細(xì)胞的免疫功能具有明顯抑制作用。腫瘤細(xì)胞種類不同，其上清產(chǎn)生免疫抑制作用的出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間及抑制程度也不同。 2.青蒿琥酯作用L929和Colon26腫瘤細(xì)胞后可顯