磷酸化15位點(diǎn)絲氨酸對Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用.pdf

1、背景:先天性白內(nèi)障是導(dǎo)致兒童失明的主要原因,大約0.3-1.5/1000的兒童患有先天性白內(nèi)障,其主要病理改變?yōu)榫铙w發(fā)育遲緩、晶狀體內(nèi)非透明瘢塊組織形成。染色體異常為先天性白內(nèi)障的主要致病原因,大量研究證據(jù)表明,轉(zhuǎn)錄因子基因突變和功能缺陷是誘發(fā)先天性白內(nèi)障的遺傳病因之一,如Pax6、FoxE3、Six3、Prox1、Sox2/3、Maf、Pitx3、AP-2a和Hsf4。在正常情況下,這些轉(zhuǎn)錄因子的瞬時激活和滅活決定晶狀體不同發(fā)育階段

2、,如Pax6在胚胎早期neuronal ectodem的表面細(xì)胞內(nèi)被激活,促使外胚層上皮細(xì)胞形成晶狀體placode和晶狀體vesicle結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向初級纖維細(xì)胞分化、調(diào)控δ-crystallin和alpha A-crystallin等多種蛋白的表達(dá)。出生后隨著晶狀體的成熟,Pax6轉(zhuǎn)錄活性被抑制。Pax6基因突變與臨床先天遺傳性白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)。熱休克轉(zhuǎn)錄因子4(Hsf4)是調(diào)控新生兒期晶狀體發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下

3、,Hsf4蛋白在胚胎E13.5晶狀體組織內(nèi)開始表達(dá),在新生兒期(P1-P28)達(dá)到高峰,隨著晶狀體成熟而逐漸減少。Hsf4 DNA結(jié)合域密碼錯義突變(如L115P、I87V、A20D和H74R)與中國和丹麥家族常染色體顯性遺傳性lamellar型白內(nèi)障,以及中國家族性顯性遺傳性總白內(nèi)障( total white cataract)的發(fā)生密切相關(guān)。敲除小鼠Hsf4基因可誘發(fā)新生期小鼠先天性白內(nèi)障,主要病理改變?yōu)榫铙w前囊上皮非正常增生、纖

4、維細(xì)胞內(nèi)變性蛋白堆積和纖維細(xì)胞終末分化障礙。因此認(rèn)為Hsf4轉(zhuǎn)錄活性對維持新生兒期晶狀體正常發(fā)育至關(guān)重要。
　　Hsf4是熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,在機(jī)體內(nèi)有兩種亞型Hsf4a和Hsf4b.它們來源于同一個基因的不同mRNA剪輯過程。Hsf4a和Hsf4b因結(jié)構(gòu)不同造成其轉(zhuǎn)錄活性相反。Hsf4a為轉(zhuǎn)錄抑制子,而Hsf4b則為轉(zhuǎn)錄激活子。晶狀體中只有Hsf4b這一種活性形式。它主要參與調(diào)控小分子熱休克蛋白(Hsp25, r-crs

5、tallin, a-crystallin和纖維細(xì)胞骨架蛋白(imentin,filesin)等蛋白的表達(dá)。其轉(zhuǎn)錄活性受磷酸化調(diào)控。但是磷酸化調(diào)控Hsf4轉(zhuǎn)錄活性的機(jī)理和相關(guān)信號通路不清楚。探討Hsf4b磷酸化調(diào)控機(jī)理對揭示Hsf4轉(zhuǎn)錄功能障礙而誘發(fā)先天白內(nèi)障的機(jī)理具有重要意義。我們應(yīng)用丙氨酸定點(diǎn)突變技術(shù),將Hsf4b分子中的高危磷酸化位點(diǎn)做突變掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsf4b DNA結(jié)合域的15位點(diǎn)絲氨酸突變對Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性有明顯的抑制作用

6、。本課題通過構(gòu)建Hsf4b DNA結(jié)合域15位點(diǎn)突變表達(dá)載體,構(gòu)建其在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株,并通過一系列實(shí)驗(yàn),集中探討了S15位點(diǎn)磷酸化對Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控機(jī)理。
　　目的:通過突變S15A位點(diǎn)研究磷酸化S15位點(diǎn)對Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控機(jī)理。
　　方法:
　　1.根據(jù)Genebank中小鼠的Hsf4b基因序列,按照設(shè)計(jì)引物的要求,使用primer premier5引物設(shè)計(jì)軟件及GPS2.1磷酸

7、化位點(diǎn)檢測軟件,設(shè)計(jì)S15位點(diǎn)突變引物:(Primer S15上游引物: GAG CCA GGC CCC GCC CCC GTG CCT GCC Primer S15下游引物:GGC AGG CAC GGG GGC GGG GCC TGG CTC)通過基因擴(kuò)增技術(shù)突變Hsf4b DNA結(jié)合域15位點(diǎn),構(gòu)建突變體載體——pWZL-HA-Hsf4b-S15A,酶切及測序鑒定突變位點(diǎn)。
　　2.將表達(dá)野生Hsf4b和突變Hsf4b/S1

8、5A的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠晶狀體上皮細(xì)胞(mLEC/Hsf4-/-),用blasticidin篩選成功構(gòu)建穩(wěn)定株。
　　3.通過western-blotting驗(yàn)證該位點(diǎn)的突變影響了其下游蛋白的表達(dá)。
　　4.設(shè)計(jì)luciferase熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測Hsf4b和Hsf4b/S15A突變體對αB-晶體蛋白(alpha B-crystallin)基因啟動子的調(diào)控。
　　結(jié)果:
　　1.通過基因擴(kuò)增技術(shù)將Hsf4b DN

9、A結(jié)合域15位點(diǎn)突變,構(gòu)建pWZL-HA-Hsf4b-S15A突變體載體。構(gòu)建其在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞(mLEC)中穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。
　　2.與野生Hsf4b相比,Hsf4b-S15A突變可明顯抑制下游蛋白HSP25、alpha B-crystallin、alpha A-crystallin的表達(dá)。
　　3.15位點(diǎn)突變后的Hsf4b能抑制alpha B-crystallin基因啟動子的轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)論:Hsf4bS1