299位點(diǎn)絲氨酸磷酸化對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控.pdf

1、背景：眼睛晶狀體發(fā)生任意程度的渾濁皆可被稱為白內(nèi)障。在晶狀體發(fā)育過(guò)程中，其上皮或纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，晶狀體蛋白組成異常均可以導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生[1~3]。白內(nèi)障是目前人類致盲的主要原因，根據(jù)發(fā)病年齡不同可以細(xì)分為先天性白內(nèi)障和老年性白內(nèi)障，老年性白內(nèi)障的發(fā)生率已達(dá)到60％-70%。隨著我國(guó)社會(huì)老齡化趨勢(shì)不斷增強(qiáng)，預(yù)防和治療老年型白內(nèi)障的發(fā)生已經(jīng)成為亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。外界環(huán)境刺激導(dǎo)致晶狀體細(xì)胞損傷是白內(nèi)障發(fā)生的一個(gè)重要原因。為應(yīng)對(duì)外界環(huán)

2、境的諸多刺激，細(xì)胞通過(guò)熱休克轉(zhuǎn)錄因子（Hsfs）大量啟動(dòng)熱休克蛋白（Hsps）的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞，促進(jìn)其存活。熱休克轉(zhuǎn)錄因子4（Heat Shock Factor4，HSF4）是熱休克轉(zhuǎn)錄因子家族（HSF）的一員，通過(guò)選擇性剪切形成了兩種不同的剪切形式：Hsf4a和Hsf4b。遺傳學(xué)分析表明 Hsf4突變與先天性家族白內(nèi)障和老年性白內(nèi)障的發(fā)生相關(guān)。敲除小鼠Hsf4基因可導(dǎo)致新生期小鼠白內(nèi)障的發(fā)生。在小鼠中，Hsf4敲除后，導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)

3、胞增殖異常，纖維細(xì)胞分化不完全，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明 Hsf4參與調(diào)控晶狀體纖維細(xì)胞分化進(jìn)程，但是具體機(jī)制并不清楚。研究發(fā)現(xiàn)Hsf4在晶狀體中高表達(dá)[4,5]，并且Hsf4b是晶狀體中Hsf4存在的唯一剪切形式[20]。Hsf4b主要表達(dá)于晶狀體上皮細(xì)胞和次級(jí)纖維細(xì)胞內(nèi)，并在晶狀體形成和分化過(guò)程中起重要作用。已報(bào)道Hsf4b蛋白可發(fā)生磷酸化、Sumo化（類泛素化）、乙?；榷喾N翻譯后修飾。Hsf4b/T472位點(diǎn)的磷酸化修飾參與調(diào)控Hsf4b與

4、入核因子inportin beta-1的相互作用，進(jìn)而調(diào)控 Hsf4b的入核和轉(zhuǎn)錄活性[22]。我們之前的研究也表明 Hsf4b/S299位點(diǎn)的磷酸化調(diào)控Hsf4b與轉(zhuǎn)錄抑制因子DAXX的相互作用[20]。并且該位點(diǎn)的磷酸化修飾對(duì)Hsf4b的轉(zhuǎn)錄活性起抑制作用。Lea Sistonen等發(fā)現(xiàn)Hsf4b也可以被sumo化修飾，進(jìn)而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性，并且Hsf4b的Sumo化依賴于Hsf4b/S299的磷酸化修飾，即Hsf4b存在一個(gè)磷酸化依

5、賴的Sumo化結(jié)構(gòu)域[19]。Hsf4b/S299A可以上調(diào)Gal-Hsf4融合蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，這些研究的結(jié)果說(shuō)明磷酸化S299對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性起抑制作用，但是，這一結(jié)論都是以腫瘤細(xì)胞為研究材料而獲得的，并且受磷酸化Hsf4b/S299抑制的自然靶向下游基因也不清楚。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)，Hsf4b參與上調(diào)小分子伴侶蛋白Hsp25和alphaB-crystallin基因表達(dá)，同時(shí)還能抑制Hsp70的表達(dá)。本課題通

6、過(guò)定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建Hsf4b/S299位點(diǎn)的突變質(zhì)粒，利用小鼠晶狀體上皮細(xì)胞構(gòu)建Hsf4b/S299A（D）突變穩(wěn)定細(xì)胞株，檢測(cè) Hsf4b/S299突變后在晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)，對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的影響，并且進(jìn)一步探討該突變影響Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的具體作用機(jī)制。
　　目的：在晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)，探討突變 Hsf4b/S299A（D）位點(diǎn)對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控機(jī)理。
　　方法：⑴設(shè)計(jì)Hsf4b/S299位點(diǎn)突變引物，通過(guò)定

7、點(diǎn)突變的方法構(gòu)建 Hsf4b/S299A和Hsf4b/S299D突變質(zhì)粒pWZL-blast-Hsf4b/S299A和pWZL-blast-Hsf4b/S299D。⑵將pWZL-blast-HA-Hsf4b/ S299A、pWZL-blast-HA-Hsf4b/S299D、空載質(zhì)粒pWZL-blast和正常質(zhì)粒正常質(zhì)粒 pWZL-blast-HA-Hsf4b分別轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293-phoenix，利用其分泌的病毒上清感染 Hsf4b

8、敲除的晶狀體上皮細(xì)胞（mLEC/Hsf4b-/-），最后用藥物（Blasticidin）篩選獲得野生型和突變型Hsf4b持續(xù)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株。⑶Western Blot和Realtime-PCR驗(yàn)證穩(wěn)定細(xì)胞株中Hsf4b/S299突變對(duì)其下游蛋白（Hsp25、αB-crystallin和Hsp70）表達(dá)的影響。⑷放線菌酮（CHX）處理Hs4b/S299野生型和突變型穩(wěn)定株細(xì)胞，檢測(cè)Hsf4b/S299突變后是否影響Hsf4b蛋白的半衰期

9、及穩(wěn)定性。⑸Hsp70和αB-crystallin promoter的luciferase assay檢測(cè)Hsf4b、Hsf4b/S299A和Hsf4b/S299D突變與hsp70和αB-crystallin基因啟動(dòng)子的DNA結(jié)合能力。⑹Chromatin Immunoprecipitation（CHIP）Assay直接檢測(cè)Hsf4b、Hsf4b/S299A和Hsf4b/S299D突變與下游基因啟動(dòng)子DNA結(jié)合能力。⑺細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢

10、測(cè)Hsf4b/S299A、Hsf4b/S299D突變對(duì)Hsf4b細(xì)胞定位的影響。
　　結(jié)果：①成功構(gòu)建pWZL-blast-HA-Hsf4b/S299A、pWZL-blast-HA-Hsf4b/S299D兩個(gè)突變質(zhì)粒。②成功構(gòu)建持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)野生型Hsf4b和突變型Hsf4b/S299A、Hsf4b/S299D的小鼠晶狀體上皮細(xì)胞穩(wěn)定株。③Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)表明 Hsf4b上調(diào)小分子熱休克蛋白 hsp25和αB-cryst

11、allin的mRNA水平而Hsf4b/S299A突變進(jìn)一步上調(diào)其mRNA水平，Hsf4b/ S299D突變對(duì)小分子熱休克蛋白hsp25和αB-crystallin的mRNA水平的調(diào)控作用與Hsf4b中無(wú)差異。Hsf4b下調(diào)Hsp70的mRNA水平，相反Hsf4b/S299A、Hsf4b/S299D失去下調(diào)Hsp70 mRNA水平的能力。④Western Blot實(shí)驗(yàn)表明，Hsf4b上調(diào)小分子熱休克蛋白hsp25和αB-crystalli

12、n的蛋白水平，而Hsf4b/S299A能夠進(jìn)一步明顯上調(diào)它們的蛋白水平，相反Hsf4b/S299D不能進(jìn)一步上調(diào)它們的蛋白水平。同時(shí)，Hsf4b下調(diào)Hsp70的蛋白水平，而Hsf4b/S299A失去下調(diào)Hsp70蛋白水平的能力，Hsf4b/S299D對(duì)下調(diào)Hsp70的蛋白水平?jīng)]明顯改變。⑤野生型Hsf4b和突變型Hsf4b/S299A、Hsf4b/S299D相比，目的蛋白Hsf4b/S299A的蛋白穩(wěn)定性降低，Hsf4b/S299D蛋白

13、相對(duì)于Hsf4b/S299A蛋白較穩(wěn)定。⑥Luciferase Assay和CHIP實(shí)驗(yàn)表明Hsf4b/S299A、Hsf4b/S299D突變影響Hsf4b與Hsp70基因啟動(dòng)子和αB-crystallin基因啟動(dòng)子的DNA結(jié)合調(diào)控能力。Hsf4b/S299A突變使其與DNA結(jié)合能力增強(qiáng)，Hsf4b/S299D突變與其DNA結(jié)合能力與Hsf4b中相比無(wú)明顯差異。⑦免疫熒光結(jié)果顯示晶狀，體上皮細(xì)胞穩(wěn)定株中Hsf4bS299A、Hsf4b/