凝血因子V和XIII基因突變的分子病理特征研究.pdf

1、先天性凝血因子Ⅴ(FactorⅤ,FV)缺乏癥也稱(chēng)副血友病,是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病,估計(jì)在人群中發(fā)病率為1/1000000。FV缺乏癥病例的出血癥狀各不相同,雜合子病例往往無(wú)明顯的臨床出血癥狀,而純合子病例則可能有輕度到重度的出血癥狀。凝血因子Ⅴ基因(F5)的突變是遺傳性凝血因子Ⅴ缺陷癥的主要分子基礎(chǔ)。至今,全世界有關(guān)遺傳性凝血因子Ⅴ缺陷癥個(gè)例報(bào)道約200多例。查詢(xún)最新的F5基因突變數(shù)據(jù)庫(kù),并對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行回顧性分析發(fā)現(xiàn),已知的

2、F5基因突變有101種民,其中錯(cuò)義突變46種,缺失突變27種,無(wú)義突變14種,插入突變7種,剪接突變7種。遺傳性凝血因子ⅩⅢ(FactorⅩⅢ,FⅩⅢ)缺陷癥是另外一種罕見(jiàn)常染色體隱性遺傳病。其主要的臨床表現(xiàn)為終生出血傾向,傷口愈合不良,習(xí)慣性流產(chǎn)等。男女均可發(fā)病,發(fā)病率約為1/2000000。自1960年Duckert等報(bào)道首例病例以來(lái),累計(jì)報(bào)道300多例,國(guó)內(nèi)僅有數(shù)例。因子ⅩⅢA鏈和B鏈基因突變是遺傳性凝血因子ⅩⅢ缺陷癥的分子基礎(chǔ)

3、。國(guó)際凝血因子ⅩⅢ基因突變注冊(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)(截至2007年1月)登記的FⅩⅢA基因突變包括:34種錯(cuò)義突變,21種插入/缺失突變,9種剪切位點(diǎn)突變,5種無(wú)義突變,FⅩⅢB基因突變僅4種。由此可見(jiàn)FⅩⅢ基因突變以FⅩⅢA基因突變?yōu)橹?FⅩⅢB基因突變僅占極小比例。近3年來(lái)許多國(guó)家的研究者相繼在人FⅩⅢ基因發(fā)現(xiàn)了一些新的突變。對(duì)遺傳性凝血因子Ⅴ缺陷癥及遺傳性凝血因子ⅩⅢ進(jìn)行分子水平的機(jī)制研究不僅有助于這類(lèi)疾病的分子診斷,更重要的是可以為這類(lèi)單基因

4、遺傳病的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的:分別對(duì)一例遺傳性凝血因子Ⅴ缺陷癥(hereditary factorⅤ deficiency,HFVD)和一例遺傳性凝血因子ⅩⅢ缺陷癥(hereditary factorⅩⅢ deficiency,HFXIIID)進(jìn)行家系分析和基因分析,鑒定凝血因子Ⅴ基因和凝血因子ⅩⅢ可能存在的基因變異；以凝血因子Ⅴ基因和凝血因子ⅩⅢ基因突變?yōu)檠芯康那腥朦c(diǎn),進(jìn)一步從分子水平研究這些突變致病的分子特征。

5、
　　 方法:1.用凝固法對(duì)疑似病例及其家庭成員的凝血指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),提取HFVD家系先證者及其家庭成員的外周血基因組DNA,PCR方法擴(kuò)增凝血因子Ⅴ基因(F5)全部外顯子和側(cè)翼序列,DNA測(cè)序方法識(shí)別F5的基因突變或多態(tài)性。以100例健康體檢者為參考,應(yīng)用等位基因特異PCR或PCR限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變進(jìn)行確證,以排除基因多態(tài)性。2.用計(jì)算機(jī)輔助剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)程序(NetGene2)對(duì)F5剪接受體位點(diǎn)點(diǎn)突變(

6、IVS16-1G>T)的效應(yīng)進(jìn)行分析,并構(gòu)建包含此點(diǎn)突變(IVS16-1G>T)的Minigene,體外試驗(yàn)分析IVS16-1G>T突變對(duì)FV mRNA前體剪接的影響。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)所發(fā)現(xiàn)突變進(jìn)行分子模建,探討突變蛋白局部及空間結(jié)構(gòu)的改變。構(gòu)建含Tyr530Ser錯(cuò)義突變和缺失60個(gè)氨基酸殘基(1779～1838)的FV基因真核表達(dá)載體,脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)觀察FV野生型和突變型重組蛋白在COS-7細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)特性。3.用尿素

7、溶解試驗(yàn)和定量試劑盒法檢測(cè)HFXIIID患者及其家系成員血漿FⅩⅢ活性,并用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定相應(yīng)血漿FⅩⅢ抗原含量。PCR方法擴(kuò)增凝血因子ⅩⅢA基因(F13A)全部外顯子和側(cè)翼序列,DNA測(cè)序方法識(shí)別F13A的基因突變或多態(tài)性。應(yīng)用直接測(cè)序、等位基因特異PCR或PCR限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變進(jìn)行確證,以排除基因多態(tài)性。4.構(gòu)建野生型FⅩⅢA重組表達(dá)質(zhì)粒,定點(diǎn)突變方法獲得含有兩種突變(Arg77Cys及Arg174

8、stop)的FⅩⅢA重組表達(dá)質(zhì)粒。分別將上述重組質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞表達(dá),熒光定量RT-PCR、Western印跡及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中人FⅩⅢA的RNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)量。
　　 結(jié)果:1.在HFVD家系中先證者和其妹妹血漿FV活性及血漿FV抗原水平都重度減低,兩者的FV基因存在雙重雜合子突變,即Tyr530Ser及IVS16-1G>T突變,其中Tyr530Ser突變是因F5外顯子1

9、1第1763位核苷酸發(fā)生C→T雜合突變導(dǎo)致,而IVS16-1G>T突變是發(fā)生在F5內(nèi)含子16剪接受體位點(diǎn)的點(diǎn)突變。家系分析表明Tyr530Ser突變和IVS16-1G>T突變分別遺傳自其父、母親,其父為T(mén)yr530Ser突變攜帶者,其母為IVS16-1G>T突變攜帶者。KpnI酶切分析及等位基因特異的PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明100例健康體檢者中均不存在這兩種突變。2.成功構(gòu)建含有點(diǎn)突變(IVS16-1G>T)的F5 Minigene。NetG

10、ene2程序能夠識(shí)別野生型F5基因第16內(nèi)含子受體剪接位點(diǎn),不能識(shí)別發(fā)生突變的第16內(nèi)含子受體剪接位點(diǎn)。體外將野生型和突變型F5 minigene重組體轉(zhuǎn)到COS7細(xì)胞,RT-PCR和DNA測(cè)序證實(shí),從野生型minigene轉(zhuǎn)染組擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為452 bp,然而從突變型minigene轉(zhuǎn)染組擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為272 bp。基因測(cè)序分析證明突變轉(zhuǎn)錄本恰好缺失了180 bp長(zhǎng)的外顯子17。計(jì)算機(jī)模擬分析預(yù)測(cè)一旦530位氨

11、基酸變?yōu)镾er,將不能維系和Glu330及Tyr415之間的氫鍵。由IVS16-1G>T突變導(dǎo)致缺失的60個(gè)氨基酸殘基位于FV分子的A3結(jié)構(gòu)域。這一缺失不僅導(dǎo)致FV A3結(jié)構(gòu)域C端β桶結(jié)構(gòu)被破壞,還導(dǎo)致銅離子與His1815和His1817之間協(xié)同作用的喪失。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)在細(xì)胞裂解物中野生型FV和兩種突變的FVs均有表達(dá)。EIISA進(jìn)一步證實(shí)Tyr530Ser和△1779-1838突變的FV抗原表達(dá)量分別降到野生型F

12、V蛋白表達(dá)量的79.5％和60.0％。野生型重組FV蛋白能夠被有效分泌到培養(yǎng)基中(FV:C60.7±19.7％；FV:Ag8.5±0.8μg/ml)。但是與轉(zhuǎn)染野生型表達(dá)質(zhì)粒組比較,轉(zhuǎn)染兩種突變質(zhì)粒的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)到的FV抗原水平則明顯減低。預(yù)測(cè)的Tyr530SerFV突變蛋白和△1779-1838突變FV蛋白的特異性活性分別是0.012 U/μg和0.043 U/μg。3.HFXIIID家系先證者FⅩⅢ基因第3外顯子和第

13、4外顯子分別存在Arg77Cys錯(cuò)義突變和Arg174stop無(wú)義突變,后者是人FⅩⅢ基因一種新突變。家系分析表明這2個(gè)突變是雙重雜合子型,Arg77Cys突變遺傳自父親,Arg174stop突變遺傳自母親。先證者女兒攜帶Arg77Cys錯(cuò)義突變。先證者丈夫及100名健康對(duì)照者均未發(fā)現(xiàn)Arg77Cys錯(cuò)義突變和Arg174stop無(wú)義突變。4.成功構(gòu)建人FⅩⅢA表達(dá)質(zhì)粒,并通過(guò)定點(diǎn)突變成功構(gòu)建含有兩種突變(Arg77Cys及Arg174

14、stop)的FⅩⅢA重組表達(dá)質(zhì)粒。含有兩種突變(Arg77Cys及Arg174stop)的FⅩⅢA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組FⅩⅢA mRNA相對(duì)表達(dá)豐度分別為0.82±0.21和0.76±0.17,與野生型FⅩⅢA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(1.06±0.51)比較沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。野生型FⅩⅢA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物中FⅩⅢ活性為61.6±30.4％,濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中FⅩⅢ活性為24.0±2.9％。而兩種突變型FⅩⅢA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂

15、解物及培養(yǎng)上清液FⅩⅢ活性明顯減低。轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物的Western Blot分析發(fā)現(xiàn)含Arg77Cys錯(cuò)義突變的FⅩⅢA重組蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)含量嚴(yán)重減低,僅見(jiàn)一條微弱的條帶。ELISA證實(shí)野生型FⅩⅢA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物中FⅩⅢA:Ag量為32.8±14.5％％,濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中FⅩⅢ:Ag量為13.2±2.3％。而兩種突變型FⅩⅢA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物及培養(yǎng)上清液中FⅩⅢA:Ag水平極度減低,低于ELISA檢測(cè)低限。

16、>　　 結(jié)論:1.在一個(gè)遺傳性HFVD家系中證實(shí)先證者和其同胞妹妹均為F5Tyr530Ser突變及IVS16-1G>T突變的雙重雜合子。兩例患者均表現(xiàn)為重度凝血因子Ⅴ缺乏,提示F5 Tyr530Ser突變及IVS16-1G>T突變共同導(dǎo)致了凝血因子Ⅴ功能的嚴(yán)重缺陷。2.體外COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)IVS16-1G>T。突變確實(shí)可以導(dǎo)致F5第17號(hào)外顯子跳躍(Skipping),將因此導(dǎo)致合成缺陷型FV蛋白,其A3結(jié)構(gòu)域內(nèi)缺失60個(gè)氨

17、基酸殘基(從1779-1838共60個(gè)氨基酸)。兩種FV突變體的體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Tyr530Ser突變和IVS16-1G>T突變單獨(dú)都可以導(dǎo)致FV重組蛋白表達(dá)量的嚴(yán)重減低,因此與FV重度缺乏密切相關(guān)。3.發(fā)現(xiàn)人FⅩⅢ基因一種新突變,即Arg174stop無(wú)義突變,并成功建立此突變的PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)方法。先證者因子ⅩⅢ基因同時(shí)存在Arg77Cys錯(cuò)義突變和Arg174stop無(wú)義突變,可能是其因子ⅩⅢ色天性缺陷的因?yàn)椤?