虎杖愈傷組織白藜蘆醇次生代謝調(diào)控體系研究.pdf

1、虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.Et Zucc.）為多年生蓼科草本植物，是我國傳統(tǒng)中藥，其主要活性成分白藜蘆醇（Resveratrol是一種天然抗毒素，同時具有多種藥理作用，被譽為最有前途的抗癌藥物之一。為了實現(xiàn)該藥用植物資源的可持續(xù)利用，以獲得高含量的白藜蘆醇為目標，本研究建立了虎杖愈傷組織無性系。從愈傷組織的光、溫培養(yǎng)條件、前體物質(zhì)苯丙氨酸的添加，以及真菌誘導(dǎo)子、水楊酸與紫外線誘導(dǎo)方面對其展開了系統(tǒng)研究，并

2、通過對誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中虎杖愈傷組織生理生化變化的分析，探討了調(diào)控措施對愈傷組織中白藜蘆醇生物合成的影響，建立了提高虎杖愈傷組織白藜蘆醇含量的調(diào)控技術(shù)。并得出以下主要結(jié)論： 1.通過研究外植體和培養(yǎng)基對愈傷組織的影響，了解到以莖段作為外植體，其愈傷組織生長比葉片快，且其中的白藜蘆醇含量為葉片中的5倍；MS培養(yǎng)基上的愈傷組織增殖量最多，其莖段和葉片的鮮重增長率均極顯著高于N6和B5培養(yǎng)基，分別達到了141.0％和73.8％，但鮮樣中白

3、藜蘆醇含量略低于B5培養(yǎng)基。因此，以MS為基本培養(yǎng)基，莖段為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織成愈較高，生長旺盛，維持時間長，白藜蘆醇含量高，優(yōu)于其他處理。 2.通過分析愈傷組織生長與白藜蘆醇含量的關(guān)系，可見在愈傷組織生長最快時期，白藜蘆醇含量增加也達到最高，因此對于虎杖愈傷組織的收獲應(yīng)選擇在愈傷組織快速生長達到飽和時的時期，整個培養(yǎng)可在同一種培養(yǎng)基中完成。 3.通過正交實驗研究了溶劑種類、時間、溫度對愈傷組織中白藜蘆醇提取率的影響

4、，極差分析結(jié)果顯示，提取工藝過程中最重要的因素為提取溫度，其次是提取時間，而提取溶劑對白藜蘆醇提取率的影響最小。綜合評價各指標，用乙酸乙酯在4℃下提取48 h效果最佳。 4.將莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織，分別置于暗光（0 lx）、弱光（1340～1560 lx）、強光（3110～3310 lx）三個條件下進行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，愈傷組織的生物量隨著光照強度的增強而增加，強光培養(yǎng)下愈傷組織的生物量達到了53.682 g/LFW。但白藜蘆醇含

5、量與光照強度不成正相關(guān)，弱光培養(yǎng)下，愈傷組織中白藜蘆醇的含量顯著高于另外兩個處理，為140.074μg/gDW。因此虎杖愈傷組織對光敏感，以弱光培養(yǎng)效果最好。25℃培養(yǎng)條件下莖段愈傷組織生長速度適宜，愈傷組織出現(xiàn)較早，愈傷組織中白藜蘆醇含量最高。 5.通過不同濃度前體物質(zhì)苯丙氨酸飼喂虎杖愈傷組織，研究發(fā)現(xiàn)10～30 mg/L濃度的苯丙氨酸能促進愈傷組織生物量的增殖，20 mg/L處理愈傷組織生物量增殖最多。用Richards方程

6、模擬愈傷組織的生物量在一個生長周期內(nèi)的動態(tài)積累過程，可以穩(wěn)健、可靠地估計不加前體物質(zhì)愈傷組織的生長動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸在一定程度上調(diào)節(jié)了愈傷組織的增長情況。由生長速率參數(shù)（K）可知，隨著苯丙氨酸濃度的增加，愈傷組織增長速度加快，極顯著高于對照16.5倍以上。且白藜蘆醇含量也隨著苯丙氨酸濃度的增加而增加，30mg/L處理白藜蘆醇的含量達到最大值，鮮樣、干樣中分別為18.025μg/g和241.489μg/g，較對照高出16.8％和5.7

7、％。 6.前體物質(zhì)苯丙氨酸能誘導(dǎo)苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性的增高，PAL的活性表現(xiàn)出隨著添加的苯丙氨酸濃度的增大而升高。各處理PAL活性的變化趨勢基本一致，都在培養(yǎng)的第7d達到最大值，表明培養(yǎng)前期，苯丙氨酸濃度的增加促進了PAL活性的增強，為白藜蘆醇的合成提供了充足的底物，促進了白藜蘆醇的合成。此外添加適量的前體物質(zhì)能延緩虎杖愈傷組織細胞的衰老，增強愈傷組織的抗性。 7.通過以黑曲霉、青霉、啤酒酵母和灰葡萄孢的粗提物為

8、誘導(dǎo)子對愈傷組織進行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)黑曲霉誘導(dǎo)子對白藜蘆醇合成的促進作用最為顯著，比對照提高了50.2％，表明虎杖對真菌誘導(dǎo)子種類具有選擇性。同時研究發(fā)現(xiàn)以100 mg/L的黑曲霉誘導(dǎo)子效果最好，比對照高128.9％。同時，誘導(dǎo)子添加時間不同對愈傷組織和白藜蘆醇含量的影響不同，以第0d加入白藜蘆醇含量最高，但對愈傷組織生物量的積累有抑制作用，而在第14d和21d加入誘導(dǎo)子對愈傷組織生物量的積累沒有影響。在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，分析白藜蘆醇含量的變化

9、規(guī)律發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)到第6天白藜蘆醇含量達到最高，為227μg/g，而在第6天后白藜蘆醇含量開始下降。綜合分析可得到虎杖愈傷組織真菌誘導(dǎo)優(yōu)化方案：在接種后第14d加入100mg/L的黑曲霉誘導(dǎo)子，誘導(dǎo)培養(yǎng)6d后收獲，可以使處理中白藜蘆醇的含量比對照提高2.25倍。 8.對黑曲霉誘導(dǎo)子組分分離研究結(jié)果表明，黑曲霉誘導(dǎo)子提取液中主要是真菌壁多糖誘導(dǎo)了愈傷組織中白藜蘆醇的生物合成，而蛋白質(zhì)對愈傷組織中白藜蘆醇的合成有抑制作用。 9.

10、通過分析真菌誘導(dǎo)子對虎杖愈傷組織中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）酶活性的影響、內(nèi)源激素脫落酸（ABA）的變化以及POD和CAT同工酶變化，研究發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)子刺激后在培養(yǎng)第1d到第4d內(nèi)源ABA含量大量產(chǎn)生，呈急劇上升趨勢，在第4d達到峰值，PAL活性迅速增加，也在第4d達到最高；同時在培養(yǎng)的前3d，SOD和POD酶活性下降，CAT在第2d出現(xiàn)第一次高峰；當(dāng)培養(yǎng)到第5d至第6

11、d，對照與誘導(dǎo)處理之間出現(xiàn)很大的差異，SOD與POD活性誘導(dǎo)處理突然出現(xiàn)下降再急劇上升的趨勢，而對照則維持較高水平；CAT在第5天出現(xiàn)第二次高峰；POD同工酶有新酶帶的出現(xiàn)。 10.通過對水楊酸添加濃度、加入時間、誘導(dǎo)時間的篩選，發(fā)現(xiàn)在接種后第14d加入7mg/L的水楊酸，誘導(dǎo)6d的效果最好，可以使白藜蘆醇比對照高近1倍，但誘導(dǎo)效果不及黑曲霉誘導(dǎo)子。黑曲霉誘導(dǎo)子與水楊酸、苯丙氨酸的進行不同組合，研究發(fā)現(xiàn)各組合對白藜蘆醇的合成均有

12、一定促進作用但與單獨添加黑曲霉誘導(dǎo)子相比變化不大，黑曲霉誘導(dǎo)子、水楊酸和苯丙氨酸三種物質(zhì)組合效果最好。 11.紫外光（30W）下20cm處照射，每次照射15 min，停止5 min，重復(fù)照射6次，2h照射時間處理，不能提高愈傷組織中自藜蘆醇含量。 12.建立了提高虎杖中白藜蘆醇含量的調(diào)控技術(shù)，以虎杖莖段為外植體，在MS+6-BA1.0+KT0.2～0.5+NAA0.2（mg/L）培養(yǎng)基上建立愈傷無性系，轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基上