microRNA-183家族在噪聲性耳聾發(fā)生及發(fā)展中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、噪聲引起的慢性聽(tīng)力損失與耳蝸內(nèi)的機(jī)械損傷和代謝障礙密切相關(guān)。人們?nèi)绻掷m(xù)在有害的噪聲環(huán)境中工作或生活，由于噪聲長(zhǎng)時(shí)間的過(guò)度刺激很可能會(huì)導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞壞死或者凋亡，耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)的氧自由基活動(dòng)增強(qiáng)和能量代謝障礙被認(rèn)為是導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞壞死或者凋亡的主要原因。隨著噪聲性聾發(fā)病機(jī)制研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)噪聲性耳聾是環(huán)境和基因兩個(gè)因素共同影響的。
　　miRNA在生物體發(fā)展過(guò)程中的作用已被廣泛的研究，許多高保守性的miRNA在特定的細(xì)胞、器

2、官和生物過(guò)程（包括疾?。┲械淖饔靡驳玫搅顺浞值恼J(rèn)識(shí)。其中miR-183家族在內(nèi)耳中具有豐量的表達(dá)，并在內(nèi)耳發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用，而且miR-183家族與聽(tīng)力損失也有密切的關(guān)系。因此，miR-183家族與聽(tīng)力損失之間相關(guān)性的研究將成為熱門。進(jìn)而探索在基因水平上的治療，特別是有關(guān)促使毛細(xì)胞再生領(lǐng)域及聽(tīng)力提高等方面。由此可見(jiàn)，miR-183家族在聽(tīng)力學(xué)領(lǐng)域有著不可估量的科學(xué)價(jià)值，同時(shí)也為人類的聽(tīng)力開(kāi)辟一條新的光明之路。
　　本課題通

3、過(guò)噪聲頻率為中心頻率2000～4000Hz的窄帶噪聲，給聲強(qiáng)度為100dB SPL，每天連續(xù)6小時(shí)，持續(xù)噪聲暴露3天來(lái)建立小鼠的噪聲性耳聾（noise-induced hearing loss，NIHL）的動(dòng)物模型，探討噪聲性耳聾對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞(hair cell，HC)的破壞程度，及檢測(cè)噪聲性耳聾前后耳蝸內(nèi)miR-183家族成員的表達(dá)變化，為進(jìn)一步闡明噪聲性耳聾的發(fā)病機(jī)制打下基礎(chǔ)，也為將來(lái)治療噪聲性耳聾提供一條新的思路。本文共分為三個(gè)部

4、分。
　　第一部分噪聲性耳聾模型的建立
　　目的:建立噪聲性耳聾動(dòng)物模型，為研究噪聲性耳聾對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞的破壞程度，及檢測(cè)噪聲性耳聾前后耳蝸內(nèi)miR-183家族成員的表達(dá)變化奠定基礎(chǔ)。
　　方法:50只小鼠隨機(jī)分為5組（1、7、14、28d組及對(duì)照組），每組10只。實(shí)驗(yàn)組給予中心頻率2000～4000Hz的窄帶噪聲，強(qiáng)度為100dB SPL，每天6小時(shí)，持續(xù)3天。對(duì)照組不接觸噪聲。在噪聲刺激前及噪聲刺激后1、7、14和2

5、8d后測(cè)ABR閾值。
　　結(jié)果:以能分辨出Ⅰ或Ⅱ波波型的最低刺激強(qiáng)度來(lái)確定ABR閾值，并重復(fù)2次。噪聲暴露后1d、7d、14d、28d組ABR平均閾值分別為62.50±3.80 dB、44.50±4.56dB、40.25±4.13 dB、40.50±3.20 dB。統(tǒng)計(jì)分析示，實(shí)驗(yàn)組噪聲刺激前后ABR閾值均有顯著性差異(P＜0.01)。噪聲刺激后，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組每組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，1d與7d、14d、28d組

6、之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，7d與14d、28d組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，14d與28d組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:此噪聲刺激可以引起小鼠聽(tīng)力的永久性閾移，證實(shí)基本成功地建立了噪聲性聽(tīng)力損害的動(dòng)物模型，為噪聲性耳聾發(fā)病機(jī)制的研究打下了基礎(chǔ)。
　　第二部分噪聲性耳聾內(nèi)耳毛細(xì)胞的研究
　　目的:檢測(cè)噪聲性耳聾后內(nèi)耳毛細(xì)胞的破壞情況，為判定噪聲通過(guò)損傷毛細(xì)胞來(lái)破壞聽(tīng)力提供依據(jù)。

7、
　　方法:各組小鼠在麻醉后迅速斷頭處死，取其雙側(cè)聽(tīng)泡。用0.5％硝酸銀溶液染色，再取其耳蝸基底膜進(jìn)行鋪片，用純甘油封片，在倒置相差顯微鏡下觀察并攝片，觀察毛細(xì)胞破壞情況。
　　結(jié)果:正常對(duì)照組小鼠耳蝸第二回基底膜可見(jiàn)三排外毛細(xì)胞（紅箭頭）和一排內(nèi)毛細(xì)胞（藍(lán)箭頭）均排列整齊，同時(shí)染色缺失率極小。清晰可見(jiàn)其外纖毛簇呈倒“v”形，內(nèi)纖毛簇呈寬“u”形;1d組內(nèi)毛細(xì)胞排列比較整齊，外毛細(xì)胞排列稍顯混亂，且大小不一，但總體缺失仍較少

8、;7d組內(nèi)毛細(xì)胞依然排列比較整齊，但外毛細(xì)胞可見(jiàn)少量缺失;14d組外毛細(xì)胞可見(jiàn)有明顯缺失，主要集中在第一、二排;28d組內(nèi)毛細(xì)胞排列較整齊，未見(jiàn)有缺失，外毛細(xì)胞見(jiàn)大量缺失。
　　結(jié)論:此程度噪聲可以引起內(nèi)耳毛細(xì)胞破壞，同時(shí)毛細(xì)胞的受損可能是小鼠噪聲性耳聾的早期病理性改變，而且這個(gè)過(guò)程至少可以延續(xù)到28天。破壞主要在外毛細(xì)胞，且多集中在第一、二排。
　　第三部分 miR-183家族在噪聲性耳聾中的表達(dá)及研究
　　目的:檢

9、測(cè)噪聲性耳聾前后耳蝸內(nèi)miR-183家族成員的表達(dá)變化，來(lái)探討miR-183家族是否參與了強(qiáng)噪聲誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞破壞的調(diào)控機(jī)制。從而為進(jìn)一步闡明噪聲性耳聾的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miR-183家族成員表達(dá)量的變化。采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果: qRT-PCR檢測(cè)顯示，噪聲刺激后1d和7d組三種基因(miR-183/96/182)的表達(dá)量較對(duì)照組均下降