P38絲裂素活化蛋白激酶-核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路在單核細胞趨化蛋白-1介導系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)合成中的調(diào)控作用.pdf

1、第一部分:單核細胞趨化蛋白-1對系膜細胞增殖及纖維連接蛋白和I型膠原表達的影響 目的:觀察不同濃度的MCP-1對體外培養(yǎng)的大鼠系膜細胞增殖及纖維連接蛋白(FN)和I型膠原(COLI)基因和蛋白質(zhì)表達的影響。 方法 1、摸索體外培養(yǎng)的大鼠系膜細胞的生長規(guī)律，繪制細胞生長曲線； 2、MCP-1的毒性實驗； 3、MCP-1的濃度梯度實驗； 4、不同終濃度的MCP-1(12.5,25,50,100

2、ng/ml)刺激體外培養(yǎng)的系膜細胞，于不同時間(12h,24h,48h)應用MTT法測定系膜細胞增殖活性； 5、不同終濃度的MCP-1(0,25,50,100ng/ml)刺激體外培養(yǎng)的系膜細胞，于不同時間(12h,24h,48h)應用半定量RT-PCR法測定系膜細胞FN和COLImRNA的相對表達量； 6、不同終濃度的MCP-1(0,25,50,100ng/ml)刺激體外培養(yǎng)的系膜細胞，于不同時間(12h,24h,48h

3、)應用WesternBlot的方法測定系膜細胞FN和COLI蛋白的相對表達量。 結(jié)論:在體外培養(yǎng)的大鼠系膜細胞體系中，MCP-1能促進大鼠系膜細胞的增殖、上調(diào)細胞FN和COLI的基因表達、促進FN及COLI蛋白質(zhì)的合成與分泌。提示MCP-1在MsPGN發(fā)病過程中起一定的作用。從新的視角探討了MsPGN的發(fā)病機制，加深對其發(fā)病機制的認識。 第二部分:P38MAPK/NF-κB信號通路在MCP-1介導系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)合

4、成中的調(diào)控作用 目的:在體外培養(yǎng)的大鼠系膜細胞培養(yǎng)體系中，探討P38MAPK/NF-κB信號通路在MCP-1介導系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)纖維連接蛋白和1型膠原合成中的調(diào)控作用。 方法1.MTT法測定單純不同終濃度SB(1，5，10μmol/L)于不同時間(12h,24h,48h)對正常培養(yǎng)的大鼠系膜細胞增殖活性的影響； 2、MTT法測定MCP-1(100ng/ml)及MCP-1(100ng/ml)+不同濃度SB(

5、1，5，10μmol/L)于不同時間(12h,24h,48h)對大鼠系膜細胞增殖活性的影響； 3、WesternBlot法于不同時間(15',30',60',120’)測定正常培養(yǎng)的大鼠系膜細胞P38MAPK磷酸化水平； 4、WesternBlot法于不同時間(12h,24h,48h)測定正常培養(yǎng)的大鼠系膜細胞NF-κBP65蛋白的表達； 5.WesternBlot法測定不同終濃度的MCP-1(25，50，100

6、ng/ml)及MCP-1(100ng/ml)+SB(10μmol/L)組于不同時間(15',30',60',120’)對大鼠系膜細胞P38MAPK磷酸化水平的影響； 6、WesternBlot法測定不同終濃度的MCP-1(25，50，100ng/ml)及MCP-1(100ng/ml)+SB(10μmol/L)組于不同時間(12h,24h，48h)對大鼠系膜細胞NF-κBP65表達的影響； 7、半定量RT-PCR法測定不同

7、終濃度的MCP-1(25,50,100ng/ml)及MCP-1(100ng/ml)+SB(10μmol/L)刺激體外培養(yǎng)的系膜細胞，于不同時間(12h,24h,48h)系膜細胞FN和COLI基因的相對表達量； 8、WesternBlot法測定不同終濃度的MCP-1(25,50,100ng/ml)及MCP-1(100ng/ml)+SB(10μmol/L)刺激體外培養(yǎng)的系膜細胞，于不同時間(12h,24h,48h)系膜細胞FN和CO

8、LI蛋白的相對表達量。 結(jié)論:在體外培養(yǎng)的大鼠系膜細胞培養(yǎng)體系中，MCP-1對MCs的增殖作用能被P38MAPK特異性阻斷劑SB所阻斷；不同濃度的MCP-1能促進大鼠系膜細胞P38MAPK磷酸化并且活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB；MCP-1呈時間和劑量依賴性地上調(diào)纖維連接蛋白和1型膠原基因及蛋白質(zhì)的表達，上述過程亦能被P38MAPK特異性阻滯劑SB203580所阻斷，提示P38MAPK/NF-κB信號通路在MCP-1介導系膜細胞增殖、