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1、第一部分:單核細(xì)胞趨化蛋白-1對(duì)系膜細(xì)胞增殖及纖維連接蛋白和I型膠原表達(dá)的影響 目的:觀察不同濃度的MCP-1對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞增殖及纖維連接蛋白(FN)和I型膠原(COLI)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。 方法 1、摸索體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線； 2、MCP-1的毒性實(shí)驗(yàn)； 3、MCP-1的濃度梯度實(shí)驗(yàn)； 4、不同終濃度的MCP-1(12.5,25,50,100
2、ng/ml)刺激體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞，于不同時(shí)間(12h,24h,48h)應(yīng)用MTT法測(cè)定系膜細(xì)胞增殖活性； 5、不同終濃度的MCP-1(0,25,50,100ng/ml)刺激體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞，于不同時(shí)間(12h,24h,48h)應(yīng)用半定量RT-PCR法測(cè)定系膜細(xì)胞FN和COLImRNA的相對(duì)表達(dá)量； 6、不同終濃度的MCP-1(0,25,50,100ng/ml)刺激體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞，于不同時(shí)間(12h,24h,48h
3、)應(yīng)用WesternBlot的方法測(cè)定系膜細(xì)胞FN和COLI蛋白的相對(duì)表達(dá)量。 結(jié)論:在體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞體系中，MCP-1能促進(jìn)大鼠系膜細(xì)胞的增殖、上調(diào)細(xì)胞FN和COLI的基因表達(dá)、促進(jìn)FN及COLI蛋白質(zhì)的合成與分泌。提示MCP-1在MsPGN發(fā)病過程中起一定的作用。從新的視角探討了MsPGN的發(fā)病機(jī)制，加深對(duì)其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。 第二部分:P38MAPK/NF-κB信號(hào)通路在MCP-1介導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合
4、成中的調(diào)控作用 目的:在體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞培養(yǎng)體系中，探討P38MAPK/NF-κB信號(hào)通路在MCP-1介導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白和1型膠原合成中的調(diào)控作用。 方法1.MTT法測(cè)定單純不同終濃度SB(1，5，10μmol/L)于不同時(shí)間(12h,24h,48h)對(duì)正常培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞增殖活性的影響； 2、MTT法測(cè)定MCP-1(100ng/ml)及MCP-1(100ng/ml)+不同濃度SB(
5、1，5，10μmol/L)于不同時(shí)間(12h,24h,48h)對(duì)大鼠系膜細(xì)胞增殖活性的影響； 3、WesternBlot法于不同時(shí)間(15',30',60',120’)測(cè)定正常培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞P38MAPK磷酸化水平； 4、WesternBlot法于不同時(shí)間(12h,24h,48h)測(cè)定正常培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞NF-κBP65蛋白的表達(dá)； 5.WesternBlot法測(cè)定不同終濃度的MCP-1(25，50，100
6、ng/ml)及MCP-1(100ng/ml)+SB(10μmol/L)組于不同時(shí)間(15',30',60',120’)對(duì)大鼠系膜細(xì)胞P38MAPK磷酸化水平的影響； 6、WesternBlot法測(cè)定不同終濃度的MCP-1(25，50，100ng/ml)及MCP-1(100ng/ml)+SB(10μmol/L)組于不同時(shí)間(12h,24h，48h)對(duì)大鼠系膜細(xì)胞NF-κBP65表達(dá)的影響； 7、半定量RT-PCR法測(cè)定不同
7、終濃度的MCP-1(25,50,100ng/ml)及MCP-1(100ng/ml)+SB(10μmol/L)刺激體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞，于不同時(shí)間(12h,24h,48h)系膜細(xì)胞FN和COLI基因的相對(duì)表達(dá)量； 8、WesternBlot法測(cè)定不同終濃度的MCP-1(25,50,100ng/ml)及MCP-1(100ng/ml)+SB(10μmol/L)刺激體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞，于不同時(shí)間(12h,24h,48h)系膜細(xì)胞FN和CO
8、LI蛋白的相對(duì)表達(dá)量。 結(jié)論:在體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞培養(yǎng)體系中，MCP-1對(duì)MCs的增殖作用能被P38MAPK特異性阻斷劑SB所阻斷；不同濃度的MCP-1能促進(jìn)大鼠系膜細(xì)胞P38MAPK磷酸化并且活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB；MCP-1呈時(shí)間和劑量依賴性地上調(diào)纖維連接蛋白和1型膠原基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)，上述過程亦能被P38MAPK特異性阻滯劑SB203580所阻斷，提示P38MAPK/NF-κB信號(hào)通路在MCP-1介導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖、
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