ADMA對(duì)內(nèi)皮生長(zhǎng)暈細(xì)胞凋亡及其相關(guān)p38絲裂素活化蛋白激酶表達(dá)的影響.pdf

1、目的:探討非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)對(duì)內(nèi)皮生長(zhǎng)暈細(xì)胞(EOCs)凋亡和粘附能力的影響以及凋亡相關(guān)p38絲裂素活化蛋白激酶(p38 MAPK)表達(dá)水平的變化。
　　 方法:采用密度梯度離心法分離臍血中的單個(gè)核細(xì)胞,接種至預(yù)先用人纖維連接蛋白包被2h的6孔培養(yǎng)板,采用己添加多種特定生長(zhǎng)因子的含10％胎牛血清的EGM-2培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后用Hanks液輕柔洗去未貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞加上述培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后一周內(nèi)每

2、24 h更換一半培養(yǎng)液,一周后每72 h換全液并于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。待鋪路石樣細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后傳代,擴(kuò)增后取第二代細(xì)胞采用免疫組化法鑒定細(xì)胞表達(dá)CD34、Flk-1、Ⅷ因子相關(guān)抗原的情況,通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的DiI-ac-LDL、FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色結(jié)果以鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞的內(nèi)皮屬性。
　　 取第二代EOCs按1×105個(gè)/孔密度接種至6孔板中并分為五組:(1)對(duì)照組:使用配制ADMA的溶劑(含

3、1％PBS的EGM-2培養(yǎng)基)與細(xì)胞共同孵育48h；(2)ADMA各濃度干預(yù)組:分別用含1、5、10、30μmol/L ADMA的EGM-2培養(yǎng)基與細(xì)胞共同孵育48h。
　　 將上述五組細(xì)胞分別采用AnnexinV-FITC/PI雙染色法行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；DAPI染色和AnnexinV-FITC/PI雙染色法在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)的改變；在倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)各組重粘附細(xì)胞數(shù)檢測(cè)細(xì)胞粘附能力；取對(duì)照組

4、以及ADMA5、10、30μmol/L處理組用特異性的Phospho-p38MAPK、total p38 MAPK抗體的蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)p38 MAPK的活性。
　　 結(jié)果:臍血中分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)第4～6天開(kāi)始出現(xiàn)梭形細(xì)胞,第6～8天左右形成若干個(gè)小的細(xì)胞集落,細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榈湫偷涅Z卵石形,細(xì)胞由中心到外周延展呈橢圓形鋪路石樣排列,同時(shí)細(xì)胞增殖進(jìn)入高峰期。在15～20d左右各個(gè)集落相互融

5、合,布滿整個(gè)六孔板底部。
　　 免疫組化染色顯示所培養(yǎng)細(xì)胞的CD34、Flk-1、Ⅷ因子相關(guān)抗原表達(dá)陽(yáng)性率均為100％。
　　 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞雙染色結(jié)果表明,所培養(yǎng)的細(xì)胞具有成熟內(nèi)皮細(xì)胞的特性,能吞噬ac-LDL并結(jié)合UEA-I。當(dāng)細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL時(shí)在綠光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光,細(xì)胞結(jié)合FITC-LYEA-Ilectin在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。
　　 以上觀察鑒定結(jié)果表明,從臍靜脈血分離獲

6、取的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)含特定生長(zhǎng)因子的EGM-2培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化培養(yǎng)并傳代后,細(xì)胞基本上為純的EOCs。
　　 AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率表明,與對(duì)照組相比,1～30μmol/L ADMA可呈濃度依賴性的誘導(dǎo)EOCs的凋亡(P<0.01)。
　　 通過(guò)DAPI染色在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài),發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,ADMA處理組可出現(xiàn)部分染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞核呈碎塊狀濃染等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變；通過(guò)An

7、nexinV/PI雙染色法在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,ADMA處理組亦可見(jiàn)到更顯著的細(xì)胞膜完整性缺失等凋亡改變。
　　 在細(xì)胞粘附能力方面,與對(duì)照組相比,1μmol/L ADMA對(duì)EOCs的粘附能力無(wú)明顯影響(18.70±4.93 vs19.75±6.00,P>0.05),5～30μmol/LADMA顯著抑制EOCs的粘附能力(P<0.05)。
　　 通過(guò)Western blot對(duì)不同濃度ADMA

8、作用于EOCs48h后細(xì)胞的p38 MAPK活性進(jìn)行檢測(cè)表明,在5～30μmol/L濃度范圍內(nèi),隨著ADMA濃度增加,Phospho-p38MAPK蛋白表達(dá)增加,而總p38 MAPK蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變,Phospho-p38/p38MAPK灰度比值隨ADMA濃度增大而增大,各處理組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論:經(jīng)密度梯度離心法獲得臍血單個(gè)核細(xì)胞,用含特定生長(zhǎng)因子的EGM-2培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化、貼壁培養(yǎng)可

9、以在體外成功獲得人臍血EOCs。通過(guò)免疫組化染色及熒光細(xì)胞化學(xué)染色可以證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞符合EOCs的表面抗原標(biāo)志表達(dá)情況以及內(nèi)皮特性。
　　 1～30μmol/L ADMA呈濃度依賴性地誘導(dǎo)EOCs凋亡。5～30μmol/L ADMA可抑制EOCs粘附能力,而1μmol/L ADMA對(duì)其粘附能力無(wú)明顯影響。
　　 ADMA對(duì)EOCs的凋亡誘導(dǎo)作用可能與p38 MAPK磷酸化水平上升有關(guān),即ADMA通過(guò)激活p38 MAPK