腺苷酸活化蛋白激酶對糖尿病腎病細胞外基質(zhì)合成的影響及機制研究.pdf

1、【目的】
　　腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）被稱為真核生物"細胞能量調(diào)節(jié)器"，能夠調(diào)節(jié)能量代謝、細胞增殖及凋亡等過程。糖尿病腎?。―N）是糖尿病常見而嚴重的并發(fā)癥，細胞外基質(zhì)沉積是其最主要發(fā)病機制之一。本文中將通過體內(nèi)、外實驗來探討糖尿病腎病中AMPK活性改變及其對糖尿病腎病的保護作用，并進行相關(guān)信號通路的研究。
　　【方法】
　　1．24只雄性 Wistar大鼠隨機分為糖尿病組（n=16）和普通飲食組（n=8），糖尿

2、病組以高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘導糖尿病模型，8周后再將其隨機分為兩組，分別經(jīng)尾靜脈導入表達持續(xù)激活型AMPKα1的重組腺相關(guān)病毒 rAAV2-AMPKα1312-CA（AMPKα1312，T172D）和作為對照的rAAV2-GFP。觀察12周后處死實驗大鼠，留取腎臟組織。PAS染色觀察比較各組大鼠腎臟的病理改變，免疫組化染色檢測各組腎臟組織Ⅳ膠原蛋白α1（Col4α1）的表達，Western blot法檢測Col4α1

3、、AMPKα1及磷酸化AMPKα1、磷酸化的乙酰輔酶A羧化酶（p-ACC）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化的mTOR及其下游分子磷酸化水平。
　　2．采用30mM葡萄糖刺激大鼠正常腎成纖維細胞株（NRK-49f），在不同時間點觀察高糖對細胞外基質(zhì)蛋白Col4α1表達、AMPK及mTOR信號通路活性的影響；然后用表達持續(xù)激活型 AMPKα1的重組腺相關(guān)病毒 rAAV2-AMPKα1312-CA（AMPKα1312，T17

4、2D）、表達抑制型AMPKα1的r-AAV2-AMPKα1-DN（AMPKα1，D157A）和rAAV2-GFP分別感染NRK-49f細胞，Western blot法檢測各組細胞Col4α1表達、AMPK及mTOR信號通路分子磷酸化水平；最后，將細胞隨機分為5組：正常糖濃度組、高糖組、高糖+雷帕霉素（rapamycin）組、高糖+r-AAV2-AMPKα1-DN組、高糖+r-AAV2-AMPKα1-DN+rapamycin組，Weste

5、rn blot法檢測各組mTOR磷酸化及Col4α1表達水平。
　　【結(jié)果】
　　1．動物實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠（C組）相比，感染rAAV2-GFP的糖尿病大鼠（GFP組）腎臟內(nèi)AMPK和ACC磷酸化水平顯著降低；與GFP組相比，感染rAAV2-AMPKα1312-CA的糖尿病大鼠（CA組）腎臟內(nèi)ACC磷酸化水平顯著升高，腎臟/體重，腎小球體積，腎小球系膜基質(zhì)增生等指標有明顯改善，細胞外基質(zhì)Col4α1表達及mTOR

6、信號通路中各分子磷酸化水平顯著降低。
　　2．高糖刺激可誘導腎成纖維細胞表達Col4α1，引起AMPK和mTOR信號通路活性改變且具有時間依賴性。引入表達持續(xù)激活型 AMPKα1的rAAV2-AMPKα1312-CA（AMPKα1312，T172D）后能夠明顯抑制基質(zhì)蛋白Col4α1的合成和mTOR信號通路活性；相反，表達抑制型AMPKα1的r-AAV2-AMPKα1-DN（AMPKα1，D157A）能夠上調(diào)基質(zhì)蛋白合成和mTOR