p38絲裂原活化蛋白激酶在豬MODS中對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome MODS)是臨床危重患者死亡的主要原因之一。目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確,臨床治療上缺乏有效的手段。1997年,Asahara等首先從外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)里分離出一種被稱(chēng)為內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的祖細(xì)胞亞群,這些細(xì)胞具有在體內(nèi)外增殖、遷徙和分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的能力以來(lái),干/祖細(xì)胞技術(shù)和理論得到了迅猛發(fā)展,多器官功能障礙綜合征的發(fā)病機(jī)制研究和臨

2、床治療也面臨著新的契機(jī)。有研究表明,機(jī)體損傷后,血循環(huán)中具有多向分化潛能的祖細(xì)胞一方面可以在VEGF等生長(zhǎng)因子作用下動(dòng)員、增殖、遷徙入損傷器官,分化為相應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行損傷修復(fù)；另一方面內(nèi)皮細(xì)胞不僅是炎癥反應(yīng)的參與者,還是首先受損的靶細(xì)胞,并進(jìn)而造成微血管損傷、微循環(huán)障礙,這可能是器官功能障礙的始發(fā)環(huán)節(jié)。大量的動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)都已經(jīng)證明：當(dāng)組織受到損傷時(shí),尤其是缺血性損傷時(shí),循環(huán)及組織中EPC動(dòng)員和增殖能力增強(qiáng),并可以在組織內(nèi)分化為內(nèi)皮細(xì)

3、胞替換功能障礙的內(nèi)皮細(xì)胞、修補(bǔ)裸露的血管內(nèi)皮損傷區(qū),并參與缺血或損傷組織內(nèi)新血管生成,從而改善缺血器官的功能；而如果創(chuàng)傷后EPC的分化、遷徙功能發(fā)生嚴(yán)重障礙,則會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷微循環(huán)嚴(yán)重?fù)p害而無(wú)法得到修復(fù),甚至發(fā)生器官功能衰竭。 近年來(lái),人們已逐漸認(rèn)識(shí)到MODS是機(jī)體對(duì)于多種嚴(yán)重?fù)p傷的一種過(guò)度的、全身性炎癥反應(yīng)的最終結(jié)果,以大量促炎因子(例如:TNF-a、IL-1β等)的過(guò)度釋放或者抗炎因子(如IL-4、IL-10等)出現(xiàn)釋放延遲為標(biāo)

4、志的過(guò)度炎癥反應(yīng)綜合征或抗炎反應(yīng)綜合征,最終導(dǎo)致機(jī)體免疫失衡和MODS的發(fā)生,和各種免疫細(xì)胞一樣,EPC也受到了細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。在MODS中,內(nèi)毒素與缺血等可以使外周血單核細(xì)胞內(nèi)的p38絲裂原活化蛋白激酶磷酸化,活化轉(zhuǎn)錄因子AP-1,進(jìn)而引起TNF-a、IL-1β基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng),TNF-a、IL-1β產(chǎn)生增多,進(jìn)而導(dǎo)致EPC下降,MODS加重。 本實(shí)驗(yàn)擬在建立豬MODS動(dòng)物模型和EPC體外培養(yǎng)和鑒定實(shí)驗(yàn)體系基礎(chǔ)上,研究觀察豬各

5、主要臟器功能變化與外周血單核細(xì)胞p38MAPK磷酸化變化與TNF-a、IL-18mRNA的表達(dá)變化和外周血血漿TNF-a、IL-1β濃度及EPC數(shù)量與功能的變化,以及在體外用不同濃度的TNF-a與IL-1β培養(yǎng)EPC,觀察其數(shù)量與功能的變化與EPC內(nèi)的p38MAPK的變化；并探討在MODS中p38MAPK介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)EPC的調(diào)控作用,從內(nèi)皮祖細(xì)胞分化障礙的角度進(jìn)一步研究創(chuàng)傷后MODS的發(fā)病機(jī)制。 全文共分三部分：

6、 第一部分 EPC的體外培養(yǎng)與生物學(xué)特性研究。方法：抽取豬骨髓20ml,用密度梯度離心法得到單核細(xì)胞,將單核細(xì)胞懸液按2×106/ml密度接種于直徑10厘米的含有各種細(xì)胞因子的培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),培養(yǎng)2天可出現(xiàn)梭形細(xì)胞,6天后梭形樣細(xì)胞數(shù)明顯增多,部分成鵝卵石狀貼壁生長(zhǎng),進(jìn)而形成細(xì)胞網(wǎng)或者管腔樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)后的細(xì)胞傳至第3代后,在免疫組化鑒定:CD133(+),CD34(+),CD31(++),KDR(++),FITC-UEA-I和Di

7、l-acLDL雙吞噬實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性,血管生成實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性,FCM檢測(cè)貼壁細(xì)胞CDl33的陽(yáng)性率：18.23±7.12％；CD34的陽(yáng)性率：47.71±14.85％；CD31的陽(yáng)性率：71.61±13.51％；KDR的陽(yáng)性率：87.24±11.40％,鑒定為EPC。在體外將TNF-a、IL-1β的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入第3代EPC,觀察其對(duì)EPC的數(shù)量、增殖、遷移、貼壁、血管新生功能的影響。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)其數(shù)量與功能與TNF-a、IL-1β有濃度與時(shí)間依賴(lài)

8、性下降,并且有顯著的差異(P<0.01),并且與p38MAPK的磷酸化密切相關(guān),用p38MAPK的特異性抑制劑SB203580(1umol/L)能減輕EPC的數(shù)量與功能下降。結(jié)論：體外TNF-a、IL-1β通過(guò)p38MAPK的磷酸化使EPC數(shù)量與功能下降,SB203580能防止EPC數(shù)量與功能下降。 第二部分 利用改良Wiggers方法復(fù)制失血性休克模型,首次打擊(失血性休克、復(fù)蘇再灌注)和二次打擊(內(nèi)毒素)復(fù)合因素成功建立豬M

9、ODS模型。方法：20頭豬隨機(jī)分為：正常對(duì)照組(C組,n=10),失血性休克+復(fù)蘇再灌注+內(nèi)毒素組(M組,n=10);通過(guò)給豬放血致平均動(dòng)脈壓50±5mmHg,維持1.5-2h,然后回輸60％所失血液和兩倍平衡液復(fù)蘇,12h后由靜脈持續(xù)滴入內(nèi)毒素(sigma,劑量0.5mg/Kg),24小時(shí)滴完。連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)心、肺、腎、肝、胃腸等功能,七天后處死存活動(dòng)物。用自動(dòng)分析儀檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)ALT、AST、Cr、 BUN、 CO、PaO2等指標(biāo),觀

10、察主要器官病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:M組外周血ALT、AST、Cr、BUN均明顯升高,動(dòng)物死亡前顯著高于正常值(P<0.01),CO,PaO2明顯下降(P<0.01);病理學(xué)改變主要以非特異炎癥改變?yōu)橹鳌組各器官的衰竭率：肺80.0％(8例),胃腸道70.0％(7例),肝50.0％(5例),腎30.0％(3例),心功能障礙(2例)20.0％, MODS發(fā)生率達(dá)90.0％(9例),死亡率達(dá)80.0％(8例),顯著高于對(duì)照組。結(jié)論：利用二次打

11、擊方法,可以成功復(fù)制出動(dòng)物MODS模型,且模型MODS發(fā)生率高,死亡率高,臨床典型的雙相遲發(fā)MODS相似重復(fù)性好。 第三部分 MODS體內(nèi)單核細(xì)胞內(nèi)p38MAPK的磷酸化對(duì)TNF-a、IL-1β合成、分泌及外周血EPC的數(shù)量與功能的影響。方法：在體內(nèi)Western-blot法檢測(cè)外周血單核細(xì)胞p38MAPK磷酸化變化與Realtime-PCR法測(cè)定TNF-amRNA、IL-1βmRNA的表達(dá)變化和ELISA法測(cè)定外周血血漿TN

12、F-a與IL-1β濃度變化及FCM檢測(cè)外周血EPC數(shù)量的變化。結(jié)果:MODS中外周血單核細(xì)胞p38MAPK的磷酸化明顯增強(qiáng)(P<0.01),TNF-a與IL-1β合成與分泌明顯增加(P<0.01)。外周血EPC數(shù)量與功能下降(P<0.05);體外TNF-a與IL-1β通過(guò)EPC內(nèi)的p38MAPK的磷酸化使EPC的數(shù)量與功能下降。結(jié)論：在MODS的發(fā)病機(jī)制中,外周血單核細(xì)胞p38MAPK的磷酸化使TNF-a與IL-1β等炎性因子的轉(zhuǎn)錄、合