新生大鼠缺氧缺血性腦損傷時(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)與新生血管形成關(guān)系的研究.pdf

1、目的：新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是新生兒時(shí)期的常見(jiàn)病，缺氧缺血是HIBD后造成腦神經(jīng)組織損傷的主要因素。圍生期窒息時(shí)，腦組織經(jīng)歷缺氧-缺血-再灌注損傷或持續(xù)低灌注的病理生理過(guò)程，從而影響腦的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致腦損傷，由此可見(jiàn)，缺氧缺血后腦組織血運(yùn)供應(yīng)的改善與神經(jīng)元功能的恢復(fù)密切相關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)家族是一組近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的血管新生因子，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤(pán)生

2、長(zhǎng)因子(PIGF)六大成員，近年來(lái)的研究表明，VEGF具有如下重要作用：(Ⅰ)調(diào)節(jié)生理和病理的血管和淋巴管的再生；(2)對(duì)外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，并直接作用于神經(jīng)元、神經(jīng)髓鞘細(xì)胞，星形細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞；(3)調(diào)節(jié)神經(jīng)再生；許多研究證明VEGF家族在成人腦血管疾病中發(fā)揮著重要作用，但有關(guān)VEGF在正常新生兒及缺氧缺血性腦損傷(HIBD)時(shí)腦組織中的分布和表達(dá)及腦組織新血管形成的研究甚少。本研究通過(guò)新生大鼠HI

3、BD動(dòng)物模型，動(dòng)態(tài)觀察正常生后7日齡新生大鼠及HIBD后不同時(shí)間腦VEGF蛋白的表達(dá)和分布以及HIBD后血管新生情況，并探討HIBD時(shí)腦皮質(zhì)VEGF蛋白表達(dá)與血管新生之間的相互關(guān)系。 材料與方法：1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分正常生后7日齡新生Wistar大鼠176只，性別不限，體重9-18克，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組88只分為HI后0、4、8、12、24、48、72小時(shí)和7、14、21、28天組，每組8

4、只；對(duì)照組88只，按上述時(shí)間點(diǎn)分組，每組8只。參照文獻(xiàn)[1]制作HIBD模型。 (Ⅰ)HIBD組：分離并結(jié)扎右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，后將大鼠置于氧濃度為5％、氮?dú)鉂舛葹?5％的密閉容器中(500mm3進(jìn)入氣體的流速5L/min)，持續(xù)時(shí)間20分鐘。 (2)對(duì)照組：僅分離右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈不予結(jié)扎和缺氧。(3)標(biāo)本采集：在缺氧缺血(HI)后不同時(shí)間點(diǎn)(0、4、8、12、24、48、72小時(shí)和7、14、21、28天)同時(shí)處死實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大

5、鼠，取腦固定，脫水，透明后浸蠟。 2.實(shí)驗(yàn)方法(Ⅰ)石蠟切片HE染色。(2)應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)VEGF蛋白在正常生后7日齡新生大鼠及HIBD后不同時(shí)間點(diǎn)的腦組織中的分布及表達(dá)情況：標(biāo)本為腦組織石蠟切片，抗原行微波加熱修復(fù)，進(jìn)行SABC染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。(3)FⅧ-Rag的免疫組織化學(xué)檢測(cè)新生血管。 3.結(jié)果判定(Ⅰ)VEGF蛋白表達(dá)：400倍光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞漿呈棕黃色，胞核為藍(lán)色淡染。

6、 (2)新生血管表達(dá)：陽(yáng)性產(chǎn)物定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿，胞核為藍(lán)色淡染。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(1)400倍光鏡下每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)抽取8張切片，每張切片取5個(gè)高倍視野(腦皮質(zhì)區(qū))，經(jīng)日本產(chǎn)的OLYMPUSBX51TF數(shù)碼相機(jī)采樣，用圖象分析系統(tǒng)選取陽(yáng)性細(xì)胞著色率達(dá)90％以上時(shí)紅黃藍(lán)達(dá)到的色差百分比作為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)metamorph軟件測(cè)定其光強(qiáng)度(OD值)作為VEGF蛋白的相對(duì)含量，將所得的OD值占總面積百分比作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較；

7、(2)新生血管計(jì)數(shù)方法參照文獻(xiàn)[2]；(3)所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差值((x)±s)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)，等級(jí)相關(guān)分析方法，P＜0.05有意義。 結(jié)果一、腦組織病理學(xué)觀察：顯微鏡下觀察：對(duì)照組大腦未見(jiàn)腦損傷形態(tài)學(xué)上的改變；模型組HI后0小時(shí)即可見(jiàn)灶狀出血，12小時(shí)神經(jīng)細(xì)胞及間質(zhì)水腫明顯，12h-24h時(shí)腦皮質(zhì)微血管可見(jiàn)明顯擴(kuò)張，72小時(shí)有軟化灶及膠質(zhì)增生小結(jié)出現(xiàn)，7天仍可見(jiàn)壞死病變。 二、新生大鼠腦組織內(nèi)VEGF蛋

8、白表達(dá)動(dòng)態(tài)變化：1.正常新生大鼠腦皮質(zhì)VEGF蛋白的表達(dá)：正常新生大鼠生后第7天于腦組織多種細(xì)胞的胞漿中即可見(jiàn)VEGF表達(dá)，并集中于皮層和海馬，亦可見(jiàn)于髓質(zhì)、軟腦膜、脈絡(luò)叢和血管內(nèi)皮細(xì)胞，于第8天表達(dá)水平增多，第9天達(dá)高峰，以后逐漸降低，持續(xù)至生后第35天。 2.HIBD后新生大鼠腦皮質(zhì)VEGF蛋白的表達(dá)：VEGF在HIBD大鼠腦組織中的表達(dá)定位與正常大鼠基本相同，于HI后0小時(shí)即可見(jiàn)表達(dá)，于HI后4小時(shí)表達(dá)逐漸增加，于48小時(shí)

9、達(dá)高峰后逐漸下降，可持續(xù)至HI后28天，并且于HI后4小時(shí)-14天時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)顯著高于對(duì)照組并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 三、HIBD后腦皮質(zhì)血管新生的動(dòng)態(tài)觀察：皮層區(qū)可見(jiàn)各時(shí)間點(diǎn)正常新生大鼠腦組織新生毛細(xì)血管數(shù)變化不大，平均約3-8條/HP；而HIBD模型組于HI后3天-28天的新生血管數(shù)顯著多于對(duì)照組(P＜0.01)，血管新生高峰期為HI后3-7天，以后一直持續(xù)較高水平。 四、于HI后0-72小時(shí)VEGF表達(dá)程度與新血管