低密度脂蛋白對(duì)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜復(fù)合體及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生物學(xué)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)及氧化低密度脂蛋白(oxidised LDL，OX-LDL)在年齡相關(guān)性黃斑變性(age related maculardegeneration，AMD)的發(fā)病中有重要作用。本研究探討LDL對(duì)脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜復(fù)合體與LDL及OX-LDL對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retina pigment epithelial，RPE)產(chǎn)生的生物學(xué)作用。
　　 方法：1.SD大

2、鼠尾靜脈連續(xù)7天注射高低不同劑量LDL，采用視網(wǎng)膜電流圖觀察大鼠的視網(wǎng)膜功能；運(yùn)用TUNEL檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡；透射電鏡觀察外層視網(wǎng)膜的超微結(jié)構(gòu)；免疫熒光的方法顯示LDL在視網(wǎng)膜中的定位。2.分別使用LDL和OX-LDL(0-100 mg/L)對(duì)RPE細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)，采用MTS觀察細(xì)胞的增殖，采用TUNEL及流式細(xì)胞觀察細(xì)胞的凋亡。3.運(yùn)用Real-time PCR及ELISA方法檢測(cè)LDL和OX-LDL(0-100 mg/L)

3、對(duì)RPE細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)后，金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinase-3，TIMP-3)的表達(dá)。4.運(yùn)用Real-timePCR及Western blot方法檢測(cè)LDL和OX-LDL(0-100 mg/L)對(duì)RPE細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)后，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelia

4、l growth factor，VEGF)及色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)的表達(dá)，并加入促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號(hào)通路抑制劑觀察蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：1.正常組、低劑量LDL組和高劑量LDL組ERG的a波振幅分別為(169.83±23.47 uv，131.57±23.79 uv

5、，90.32±19.86 uv)，b波振幅分別為(395.2±41.12 uv，243.31±30.45 uv，169.77±27.6 uv)，低、高劑量LDL組與正常組相比均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，但各組間a波、b波潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。TUNEL檢測(cè)提示尾靜脈注射LDL后，高、低劑量組在外核層可見(jiàn)黃染的陽(yáng)性細(xì)胞，而正常組視網(wǎng)膜未見(jiàn)黃染細(xì)胞。電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示在正常對(duì)照組Bruch膜厚度為594.79±261.9

6、2 nm，低劑量LDL組為731.42±336.09 nm，高劑量LDL組為861.58±340.19 nm。高劑量LDL組與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在高劑量LDL組還可見(jiàn)RPE細(xì)胞內(nèi)皺褶減少，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，并可見(jiàn)脂質(zhì)顆粒；Bruch膜厚度較正常組比明顯增厚，特別是局灶性增厚明顯。脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的窗孔減少，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞，視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞間有空隙存在。2.與SFM相比，用10-100 mg/L LDL

7、處理24h后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)RPE細(xì)胞有毒性，10mg/L LDL對(duì)RPE細(xì)胞有輕度促增殖作用，OX-LDL處理24h后引起細(xì)胞活力下降，與SFM和10-100 mg/L LDL相比，10-100 mg/LOX-LDL處理24 h后能誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡率增加2-3倍(P<0.05)。與SFM對(duì)照組相比，10-100 mg/L LDL組的凋亡率無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)。3.MMP-2及TIMP-3基礎(chǔ)分泌量為6.455±0

8、.85 ng/mL及267.25±41.12 pg/mL。10，50，100 mg/L LDL及10 mg/L OX-LDL處理后，MMP-2蛋白表達(dá)量降低，而10及50 mg/LOX-LDL處理后，TIMP-3蛋白表達(dá)量增加。LDL和OX-LDL處理RPE細(xì)胞后，MMP/TIMP率失調(diào)。4.OX-LDL處理RPE細(xì)胞后，VEGF表達(dá)量升高，PEDF表達(dá)量降低，VEGF/PEDF表達(dá)率失調(diào)，P38抑制劑SB203580預(yù)處理后，OX-L

9、DL引起的VEGF表達(dá)量下降接近50％，PEDF表達(dá)量也有下降。而JUK抑制劑SP600125處理后，VEGF表達(dá)量略有下降。
　　 結(jié)論：1.外源性LDL能誘發(fā)大鼠視網(wǎng)膜發(fā)生部分近似AMD的改變，如：視網(wǎng)膜功能下降、Bruch膜增厚、光感受器細(xì)胞凋亡、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)等。2.OX-LDL處理24h后引起細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡率增加。3.LDL和OX-LDL處理RPE細(xì)胞后，MMP/TIMP率失調(diào)。4.OX-LDL處理RPE細(xì)胞后