枸杞糖綴合物L(fēng)bGp4及其糖鏈LbGp4-OL與小鼠B淋巴細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的研究.pdf

1、本研究主要主要研究了枸杞糖綴合物L(fēng)bGp4及其糖鏈LbGp4-OL與淋巴細(xì)胞的作用方式，探討了其在B細(xì)胞上的特異性結(jié)合位點(diǎn)及其活化B細(xì)胞的初步分子機(jī)理。 一、3H-LbGp4及3H-LbGp4-OL與B淋巴細(xì)胞的結(jié)合應(yīng)用放射配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)分別研究了3H-LbGp4及3H-LbGp4-OL與B淋巴細(xì)胞的結(jié)合特性。結(jié)果表明，3H-LbGp4達(dá)到5.82pM時(shí)與B細(xì)胞的特異性結(jié)合趨向飽和，平衡解離常數(shù)Kd=2.973pM，親和常數(shù)K=0

2、.3364pM-1，提示3H-LbGp4與B淋巴細(xì)胞的結(jié)合具有較強(qiáng)的親和力。最大結(jié)合Bmax=14.50fM。受體動(dòng)力學(xué)研究表明，結(jié)合時(shí)相參數(shù)(平衡時(shí)結(jié)合配基的濃度)RLeq=12.25fM，有效速度常數(shù)(k12×L*+K21)為O.1464fM/min，t1/2=4.734min；解離時(shí)相參數(shù)k21=-0.0137，t1/2=50.58min。 3H-LbGp4-OL與靜息B細(xì)胞的結(jié)合亦具有較好的飽和性，其結(jié)合參數(shù)Kd=2.4

3、131pM，Bmax=89.82fM，親和常數(shù)K=0.4144pM-1，提示3H-LbGp4-OL與靜息B細(xì)胞結(jié)合具有較好的飽和性和特異性，親和性較強(qiáng)。受體動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，結(jié)合時(shí)相參數(shù)Rleq=21.48909fM，有效速度常數(shù)(k12×L*+k21)為0.0224fM/min，t1/2=30.94min；解離時(shí)相參數(shù)k21=-0.023，t1/2=30.13min。當(dāng)加入4.7至10.0μM非標(biāo)LbGp4-OL時(shí)，3H-LbGp4

4、-OL與B細(xì)胞的特異性結(jié)合量變化最明顯，當(dāng)非標(biāo)LbGp4-OL低于4.7μM或大于10.0μM均對(duì)其特異性結(jié)合無(wú)明顯影響，表明3H-LbGp4-OL與B細(xì)胞的特異性結(jié)合具有較強(qiáng)的親和性。 二、構(gòu)成LbGp4及LbGp4-OL的單糖對(duì)3H-LbGp4及3H-LbGp4與B細(xì)胞結(jié)合的影響LbGp4的糖鏈由四種單糖組成，即阿拉伯糖(阿)、半乳糖(半)、鼠李糖(鼠)和木糖(木)，其組成比為1.5：2.5：0.43：0.23。同時(shí)應(yīng)用阿、

5、半、鼠、木四種單糖或阿、半、鼠三種單糖可阻斷3H-LbGp4與靜息B細(xì)胞的特異性結(jié)合，但阿、半或半、鼠兩種單糖同時(shí)應(yīng)用時(shí)對(duì)3H-LbGp4與B細(xì)胞的特異性結(jié)合無(wú)阻斷作用，而木糖的存在與否不影響3H-LbGp4與靜息B細(xì)胞的特異性結(jié)合。應(yīng)用熒光素FITC標(biāo)記LbGp4-OL，然后進(jìn)行與靜息B細(xì)胞的飽和實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與放射配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)相似，但親和力較低。 LbGp4-OL由三種單糖組成，分別為阿、半和鼠，其組成比為1.33：1.0：0.

6、05。同時(shí)應(yīng)用三種單糖對(duì)3H-LbGp4與靜息B細(xì)胞的特異性結(jié)合有阻斷作用，而分別應(yīng)用以上三種單糖任何兩兩組成對(duì)3H-LbGp4與靜息B細(xì)胞的特異性結(jié)合均無(wú)明顯阻斷作用。 三、不同濃度糖鏈構(gòu)成單糖對(duì)3H-LbGp4-OL與靜息B細(xì)胞結(jié)合的影響按比例混合阿、半、鼠三種單糖，分別觀察是正常濃度1倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍和0.2倍時(shí)對(duì)3H-LbGp4-OL與靜息B細(xì)胞特異性結(jié)合的影響。結(jié)果表明，隨濃度的增高，阻斷作用增強(qiáng)。

7、 四、FITC-LbGp4-OL與靜息B細(xì)胞結(jié)合的飽和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光素FITC標(biāo)記LbGp4-OL，然后進(jìn)行與靜息B細(xì)胞的飽和實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，F(xiàn)ITC-LbGp4-OL與靜息B細(xì)胞的結(jié)合具有較好的飽和性；Scatchard作圖曲線呈直線分布，Kd=232.56pM，Bmax=162.70fM，親和常數(shù)K=0.0043pM-1，提示HTC-LbGp4-OL與靜息B細(xì)胞的特異性結(jié)合具有較好的飽和性，但親和性較低。 五、3H-LbG

8、p4-OL與其它組織細(xì)胞結(jié)合的飽和實(shí)驗(yàn)分別觀察了3H-LbGp4-OL與成年大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞、胚胎大鼠海馬及下丘腦神經(jīng)細(xì)胞以及小鼠脾T淋巴細(xì)胞的結(jié)合情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3H-LbGp4-OL與上述組織細(xì)胞均無(wú)飽和性，總結(jié)合與非特異性結(jié)合幾乎完全重疊；Scatchard曲線呈不規(guī)律分布，提示3H-LbGp4-OL與上述組織細(xì)胞無(wú)特異性結(jié)合。 六、LbGp4-OL與靜息B細(xì)胞結(jié)合部位的定位研究應(yīng)用熒光素標(biāo)記LbGp4-OL，然后按受

9、體飽和實(shí)驗(yàn)的方法與靜息B細(xì)胞孵育，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡(Confocal)觀察FITC-LbGp4-OL與B細(xì)胞的結(jié)合情況，然后選擇熒光細(xì)胞進(jìn)行斷層掃描，觀察熒光分布情況。結(jié)果表明，F(xiàn)TTC-LbGp4-OL結(jié)合于B細(xì)胞表面，提示LbGp4-OL的特異性結(jié)合部位位于細(xì)胞膜。 七、LbGp4和LbGp4-OL對(duì)B細(xì)胞蛋白激酶C活性的影響將LbGp4(2.32，1.16，0.58nM)和LbGp4-OL(2.76，1.38，0.69

10、nM)與B細(xì)胞共同孵育，進(jìn)而測(cè)定B細(xì)胞蛋白激酶C(PKC)活性。結(jié)果表明，LbGp4和LbGp4-OL對(duì)B細(xì)胞PKC活性無(wú)明顯影響。 八、LbGp4和LbGp4-OL對(duì)B細(xì)胞酪氨酸激酶活性的影響將LbGp4(2.32，1.16，0.58nM)和LbGp4-OL(2.76，1.38，0.69nM)與B細(xì)胞共同孵育，進(jìn)而測(cè)定蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。結(jié)果表明，LbGp4和LbGp4-OL可明顯提高B淋巴細(xì)胞PTK活性。LbGp4

11、提高PTK活性分別是對(duì)照組的202.73％，160.28％和127.77％；LbGp4-OL提高PTK活性分別是對(duì)照組的250.77％，191.49％，145.24％。 第4頁(yè)九、LbGp4和LbGp4-OL對(duì)B細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和BSAP的影響 結(jié)果表明，LbGp4和LbGp4-OL對(duì)核因子NF-κB表達(dá)具有明顯的上調(diào)作用，加入LPS或PWM則對(duì)NF-κB蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。LbGp4和LbGp4-OL對(duì)B細(xì)胞特